动态高压微射流对刺梨果渣膳食纤维及其抑制淀粉消化和葡萄糖扩散的影响

官印珑，周丽妍，王 辉，陈佳雨，明 建，李富华,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.贵州省农业科学院生物技术研究所，贵州 贵阳 550006）

国际糖尿病联盟2019年的统计数据表明，我国糖耐量受损人群位居世界第一。究其原因，可能是我国居民膳食精细化程度不断提高，而膳食纤维的摄入量严重不足所致[1]。调查显示仅有20%的国民达到膳食纤维的推荐摄入量[2]。研究发现，膳食纤维摄入量不足易引发肥胖症、高血糖等慢性疾病[3-4]。

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）又称刺莓果，因富含多种营养和生物活性物质而成为药食领域的研究热点。刺梨果渣，作为刺梨加工的主要副产物，其优质膳食纤维含量占果实干质量的23.8%、鲜质量的4.2%，且该含量高于作为纤维来源食物3%的要求，属于优质膳食纤维资源[5-6]。研究指出纤维原料中，可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）与不可溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）的质量比接近1∶2时，可作为良好的食物添加剂，而刺梨果渣中SDF与IDF的含量比例满足该要求[7-10]。因此，刺梨果渣膳食纤维的质量极佳。目前有研究发现刺梨具有降低血糖的功能活性[11-12]。但刺梨果渣膳食纤维的降血糖活性以及经物理改性后其结构和活性的变化情况依然不清楚。

动态高压微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）作为一种以超高压理论、流体力学理论、撞击理论为基础的新兴高压加工技术，在食品大分子的改性和超微化领域具有广阔的应用前景[13-14]。研究发现DHPM处理不仅可以改变膳食纤维的理化性质如色泽、持水力、膨胀力、平均分子质量和单糖组成等，还能够改善膳食纤维的生理活性[15-18]。但在刺梨纤维改性后其理化性质和降血糖功能之间的联系依然有待挖掘。

因此，本研究重点探究刺梨果渣SDF与IDF的理化性质和降血糖活性，以及DHPM改性处理对刺梨果渣SDF理化指标和淀粉消化、葡萄糖扩散调控作用的影响，为膳食纤维的DHPM改性处理在降血糖方面的应用以及刺梨果渣的开发利用提供理论研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨果渣（含水率约10%）由贵州省生物技术研究所提供；耐高温α-淀粉酶（活力≥20 000 U/mL）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、胰淀粉酶（活力≥4 000 U/g）、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂、透析袋 南京都莱生物技术有限公司；葡萄糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钠、盐酸、无水乙醇均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高压微射流纳米均质机 加拿大Microfluidics公司；FW100高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；HR-1旋转流变仪 美国TA公司；纳米粒度及Zeta电位分析仪 英国马尔文公司；全自动比表面积及孔隙度分析仪 美国麦克默瑞提克公司；紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；F-2500荧光分光光度计日本日立公司；圆二色光谱仪 英国应用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1 膳食纤维提取

刺梨果渣经FWl00高速万能粉碎机粉碎后，过60～80 目筛后得到刺梨果渣粉，然后参考GB 5009.88ü2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》，提取膳食纤维。准确称取5.00 g刺梨果渣粉末于250 mL锥形瓶中，加入50 mL PBS（0.05 mol/L、pH 8.2）和25 μL 20 000 U/mL的耐高温α-淀粉酶，95 ℃条件下水解40 min，所得水解液备用。在水解液中加入4 倍体积95%（体积分数，下同）乙醇溶液，醇沉2 h后离心（3 000 r/min、10 min），沉淀物在55 ℃条件下热风烘干，即得全膳食纤维（total dietary fiber，TDF）。水解液经离心（3 000 r/min、10 min）、过滤后收集滤液和滤渣，滤渣用70 ℃去离子水洗涤3 次，干燥后即得IDF；滤液中加入4 倍体积95%乙醇溶液，醇沉2 h后离心（3 000 r/min、10 min），离心所得沉淀物在55 ℃条件下热风烘干，即得SDF。

1.3.2 DHPM处理

DHPM处理参照文献[18]并稍作修改。按料液比1∶25（m/V）将SDF样品与0.05 mol/L pH 6.5的PBS充分混合均匀后进行3 次高压微射流纳米均质处理，上样量为200 mL，压力为100 MPa，处理后所得样品即DHPM-SDF。

1.3.3 流变特性分析

用0.05 mol/L pH 6.5的PBS按照料液比1∶25（m/V）配制膳食纤维样品分散体系，流变仪中上样量为1 mL，选择直径25 mm的平板夹具进行测量。间隙设置为50 μm，测定温度为25 ℃。测试样品溶液在剪切速率从0～100 s－1时的静态剪切流变特性，结果以表观黏度来表征。

1.3.4 平均粒径测定

20 ℃条件下，以无水乙醇作为分散剂，配制质量浓度为1 g/L的膳食纤维样品悬浮液，搅拌均匀后，置于纳米粒度及Zeta电位分析仪中测定平均粒径，每个测试样检测3 次。

1.3.5 比表面积测定

采用全自动比表面积及孔隙度分析仪测定样品的比表面积。准确称量100 mg的膳食纤维样品（IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF），测试前经80 ℃氮气吹扫2 h以除去吸附在样品表面的水分。其中吸附使用氦气为载气，脱气时间4 h。样品吸附峰面积与已知比表面积的标准碳黑吸附峰面积对比，从而计算样品的比表面积。

1.3.6 葡萄糖吸附能力测定

参照文献[19]测定葡萄糖吸附能力。分别将1 g的膳食纤维样品与100 mL 100 mmol/L葡萄糖溶液（以0.05 mol/L pH 6.5的PBS为溶剂）置于酶反应器中混合均匀，以100 mL PBS为空白对照，以100 mL不含膳食纤维样品的100 mmol/L葡萄糖溶液为葡萄糖对照组，37 ℃下反应6 h。然后将反应液转移至离心管中，3 000 r/min离心15 min，取上清液，采用DNS法测定上清液中葡萄糖的浓度并换算为葡萄糖物质的量。按式（1）计算葡萄糖吸附能力。

式中：m为膳食纤维纤维样品质量/g；n0为空白对照组的葡萄糖物质的量/mmol；n1为样品组葡萄糖物质的量/mmol；n2为葡萄糖对照组的葡萄糖物质的量/mmol。

1.3.7 抑制葡萄糖扩散能力分析

膳食纤维抑制葡萄糖扩散能力以葡萄糖透析延迟系数表示，参照文献[20]进行测定。分别将0.2 g膳食纤维样品与10 mL 100 mmol/L葡萄糖溶液（溶剂为0.05 mol/L、pH 6.5的PBS）混匀后，装入10 cm长的透析袋（直径44 mm）中，透析液为200 mL蒸馏水，对照组为不含膳食纤维样品的10 mL 100 mmol/L葡萄糖溶液，在37 ℃条件下透析5 h，分别在反应30、60、90、120、150 min时，取一定量透析液，采用DNS法测定透析液中葡萄糖的浓度并换算为葡萄糖物质的量，即不同条件下的葡萄糖扩散能力，膳食纤维对葡萄糖透析延迟系数按式（2）计算。

式中：n0为对照组透析液中葡萄糖物质的量/mmol；n1为样品组透析液中葡萄糖物质的量/mmol。

1.3.8 胰淀粉酶消化分析

胰淀粉酶消化分析参照文献[20]。准确称取40 g马铃薯淀粉置于2 000 mL烧杯中，加入900 mL 0.05 mol/L pH 6.5的PBS，放入70 ℃水浴锅中搅拌糊化30 min，最后加PBS定容至1 000 mL，得到40 g/L马铃薯淀粉溶液。量取10 mL马铃薯淀粉溶液（40 g/L），加入0.04 g胰淀粉酶，同时分别加入0.2 g SDF、IDF、TDF、DHPM-SDF混匀，装入透析袋中，不添加膳食纤维提取物的混合体系为对照组。以200 mL蒸馏水为透析液，在37 ℃下透析3 h，分别在反应时间为30、60、90、120、150 min时取一定量透析液，沸水浴加热5 min，然后采用DNS法测定各透析液中葡萄糖物质的量。

1.3.9 胰淀粉酶活力抑制分析

胰淀粉酶活力抑制分析参照文献[20]。准确量取50 mL马铃薯淀粉溶液（40 g/L），分别加入1.0 g膳食纤维提取物（IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF）和4 mg胰淀粉酶，混匀，以不加膳食纤维的50 mL马铃薯淀粉溶液（含4 mg胰淀粉酶）为对照。在37 ℃下磁力搅拌反应30 min，沸水浴加热5 min。然后转移至离心管中，3 500 r/min离心15 min，取上清液测定生成的葡萄糖物质的量，分别按式（3）、（4）计算葡萄糖产生速率和淀粉酶活力抑制率。

式中：n0为对照组葡萄糖物质的量/mmol；n1为样品组葡萄糖物质的量/mmol。

1.3.10 胰淀粉酶荧光猝灭分析

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胰淀粉酶荧光猝灭分析参照文献[21]。用0.05 mol/L pH 6.5的PBS配制质量浓度0.25 mg/mL的胰淀粉酶溶液，将10 mL的胰淀粉酶溶液分别与0.01 g的IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF混匀，以不加膳食纤维样品的10 mL胰淀粉酶液为对照，混合液在25 ℃下反应30 min，然后沸水浴加热5 min。3 500 r/min离心30 min，取上清液测定其中胰淀粉酶的荧光强度变化。荧光强度测定条件为：激发波长分别为280 nm和295 nm，荧光分光光度计的扫描速率为12 000 nm/min，激发和发射狭缝宽度均为5 nm，在波长范围为300～500 nm内记录发射光谱，分辨率为2.0 nm。

1.3.11 胰淀粉酶的二级结构分析

胰淀粉酶的二级结构分析参照文献[21]。用0.05 mol/L pH 6.5的PBS配制质量浓度0.1 mg/mL的胰淀粉酶溶液。量取10 mL胰淀粉酶溶液置于离心管中，分别加入0.05 g IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF，以不加膳食纤维样品的10 mL胰淀粉酶液为对照，混匀后静置5 min，过滤，取滤液进行圆二色光谱分析。具体条件：分辨率为1 nm；扫描速率为100 nm/min；响应时间为1 s；光栅狭缝为2 nm。胰淀粉酶对左、右旋圆偏振光的吸收率不同，测定其一定波长下吸光系数的差值Δε。通过Chirascan软件对近紫外圆二色光谱图进行分析，计算α-螺旋、β-转角和无规卷曲的相对含量。

1.4 数据处理与分析

实验重复3 次，结果用平均值±标准差表示。采用Origin 8.0软件作图，采用SPSS 22软件进行单因素方差分析，通过Duncan’s多重比较显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同刺梨果渣膳食纤维的平均粒径和比表面积

由表1可知，SDF的平均粒径（1 196 nm）显著低于其他膳食纤维样品（P＜0.05），IDF和TDF的比表面积显著低于SDF（P＜0.05），其中IDF比表面积最低，为2.98 m²/g。与SDF相比，DHPM-SDF平均粒径增加了2.08 倍，DHPM-SDF的比表面积显著降低（P＜0.05），说明DHPM处理可显著改变SDF的平均粒径和比表面积。根据Guo Xiaojuan等[22]的报道，这可能是因为DHPM处理过程中产生瞬间巨大的压力差，导致刺梨果渣膳食纤维物料颗粒从组织内部发生爆裂、膨化，使得颗粒粒径增加，比表面积减小。

表1 刺梨果渣膳食纤维样品的平均粒径和比表面积Table 1 Comparison of the average particle sizes and specific surface areas of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace

2.2 不同刺梨果渣膳食纤维的流变特性

由图1可知，SDF和DHPM-SDF表观黏度较小，IDF和TDF的表观黏度很小，且与蒸馏水溶液没有明显差别。SDF组随着剪切速率的增加，其表观黏度呈下降趋势，说明SDF溶液属于非牛顿流体。在同一剪切速率下，经过DHPM处理后SDF的表观黏度明显减小。根据Chen Huanhuan等[21]的报道，这可能是SDF在DHPM处理过程中，由于高剪切力和湍流力，造成了无序或有序的构象转变以及多糖分子链的断裂，最终使得溶液黏度有所减小。

图1 刺梨果渣膳食纤维样品表观黏度随剪切速率的变化Fig. 1 Apparent viscosity of dietary fiber samples as a function of shear rate

2.3 不同刺梨果渣膳食纤维对葡萄糖的吸附作用

刺梨果渣SDF、IDF、TDF都具有吸附葡萄糖的能力，这表明刺梨果渣膳食纤维都有助于降低肠腔中葡萄糖的浓度，可作为降血糖产品开发的潜在优良资源。如图2所示，SDF对葡萄糖的吸附能力显著低于其他膳食纤维（P＜0.05），其中，IDF葡萄糖的吸附能力是SDF的1.28 倍，而DHPM-SDF、IDF、TDF葡萄糖吸附能力没有显著性差异（P＞0.05）。类似的，杨晰茗等[23]发现食用菌IDF对葡萄糖吸附能力显著高于食用菌SDF（P＜0.05）。与SDF相比，DHPM-SDF的葡萄糖吸附能力提高了28.13%，说明DHPM处理是提高SDF吸附葡萄糖的有效手段。Morales等[24]的研究表明，DHPM处理能够增大SDF的颗粒粒径和孔隙，这有助于截留葡萄糖分子，从而提高SDF对葡萄糖的吸附作用。

图2 刺梨果渣膳食纤维样品对葡萄糖的吸附能力Fig. 2 Glucose adsorption capacity of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace

2.4 不同刺梨果渣膳食纤维对葡萄糖扩散的抑制作用

图3 刺梨纤维对葡萄糖扩散能力（A）和葡萄糖扩散抑制力（B）的影响Fig. 3 Effects of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace on glucose diffusion (A) and glucose dialysis retardation index (B)

2.5 不同刺梨果渣膳食纤维对淀粉消化的影响

刺梨果渣膳食纤维对淀粉消化的抑制作用如图4所示，与对照组相比，刺梨果渣膳食纤维样品组的葡萄糖物质的量明显降低。在反应时间150 min时，DHPM-SDF组透析液中葡萄糖的物质的量最小，而SDF和IDF没有明显差异，说明SDF和IDF对淀粉消化抑制能力相近，而DHPM-SDF对淀粉消化抑制能力最大；与对照组相比，DHPM-SDF组透析液中葡萄糖物质的量下降了约11.89%～23.19%。根据Zhang Hui等[26]的报道，推测膳食纤维抑制淀粉酶消化的原因可能是膳食纤维分子与胰淀粉酶发生相互作用，阻碍胰淀粉酶与底物的作用。根据Ma Mengmei等[27]的报道，超高压微射流处理可使膳食纤维的孔隙率和功能基团的裸露度增加，提高了其对淀粉酶的吸附能力以及活性位点结合能力，导致淀粉酶活力下降，最终使淀粉的消化速率降低。

图4 刺梨果渣膳食纤维对淀粉消化的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effects of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt.pomace on starch digestibility

2.6 不同刺梨果渣膳食纤维对胰淀粉酶荧光猝灭作用

当胰淀粉酶与功能性物质发生相互作用后，其荧光强度发生明显降低，这称为荧光猝灭作用。胰淀粉酶含有酪氨酸和色氨酸残基，酪氨酸和色氨酸残基是引起蛋白质荧光的主要氨基酸残基，在280 nm激发波长下主要是酪氨酸产生荧光，295 nm激发波长下主要是色氨酸产生荧光。

如图5所示，胰淀粉酶溶液中加入刺梨果渣膳食纤维后，其荧光强度均明显降低。说明TDF、IDF、SDF均能作用于胰淀粉酶的酪氨酸和色氨酸残基。其中，TDF组的荧光强度最高，而SDF组最低，DHPM-SDF组荧光猝灭能力高于SDF组，这与图4结果类似。膳食纤维分子与胰淀粉酶分子的主要结合位点是酶中的酪氨酸、色氨酸等氨基酸残基，通过吸附胰淀粉酶而阻碍胰淀粉酶与底物的作用，最终降低淀粉的消化速率[28-29]。

图5 在280 nm（A）和295 nm（B）激发波长下刺梨果渣膳食纤维对胰淀粉酶荧光猝灭的光谱图Fig. 5 Influence of dietary fibers of Rosa roxburghii Tratt. pomace on emission spectra of pancreatic amylase at the excitation wavelengths of 280 nm (A) and 295 nm (B)

2.7 不同刺梨果渣膳食纤维对胰淀粉酶活力的影响

在有膳食纤维样品存在的情况下，胰淀粉酶与淀粉的水解反应维持30 min后，各样品组胰淀粉酶对淀粉的水解速率（以葡萄糖产生速率表示）以及胰淀粉酶活力的变化如图6所示，与对照组葡萄糖产生速率（109 μmol/h）相比，刺梨果渣膳食纤维（尤其是SDF和DHPM-SDF）干预组的葡萄糖产生速率显著降低（P＜0.05），其中DHPM-SDF葡萄糖产生速率仅为97 μmol/h。IDF和TDF的淀粉酶活力抑制率分别约为4.40%、4.04%，SDF和DHPM-SDF的胰淀粉酶活力抑制率分别为7.63%、11.01%，SDF对胰淀粉酶活力的抑制能力是IDF的1.73 倍，DHPM-SDF对胰淀粉酶活力的抑制率最高，是SDF的1.44 倍，与图4的结果一致。DHPM处理可能导致SDF粒径和裸露的功能基团数量增加，提高了SDF与胰淀粉酶活力位点的结合能力，并可能改变胰淀粉酶的空间二级结构，使得胰淀粉酶与底物间作用减弱，胰淀粉酶活力下降，最终使得淀粉水解速率下降[27]。因此，进一步分析在IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF干预条件下胰淀粉酶二级结构的变化。

图6 刺梨果渣膳食纤维样品对胰淀粉酶活力的影响Fig. 6 Effects of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace on pancreatic amylase activity

2.8 不同刺梨果渣膳食纤维对胰淀粉酶二级结构影响

图7 胰淀粉酶与刺梨果渣膳食纤维反应后的近紫外圆二色光谱Fig. 7 Near UV-circular dichroism spectra of pancreatic amylase affected by dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace

胰淀粉酶与刺梨纤维相互作用后的近紫外圆二色光谱如图7所示。在各膳食纤维样品干预下，胰淀粉酶二级结构中的α-螺旋、β-转角和无规卷曲的相对含量如表2所示，与对照组相比，各组样品中胰淀粉酶α-螺旋和无规卷曲的相对含量总体上显著下降（P＜0.05）。各组β-转角相对含量的变化规律不明显，与对照组相比，SDF与IDF组β-转角的相对含量显著减小（P＜0.05）。与SDF组相比，DHPM-SDF组β-转角相对含量增大，而α-螺旋、无规卷曲相对含量显著减小（P＜0.05）。

表2 胰淀粉酶与刺梨纤维作用后的二级结构相对含量的变化Table 2 Changes in the secondary structure of pancreatic amylase affected by dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace

整体而言，各组胰淀粉酶的α-螺旋相对含量由低到高依次为TDF＜IDF＜DHPM-SDF＜SDF＜对照组。α-螺旋相对含量的减小，说明酶与刺梨果渣膳食纤维作用后，其二级结构不断伸展，引发活性位点的暴露，从而更容易被酶抑制因子钝化。IDF组α-螺旋相对含量下降幅度显著高于SDF组（P＜0.05）。相比于SDF组，DHPM-SDF显著降低胰淀粉酶的α-螺旋相对含量（P＜0.05）。各组胰淀粉酶的无规卷曲相对含量由低到高依次为DHPM-SDF＜SDF＜TDF＜IDF＜对照组。无规卷曲是指不能被归入明确二级结构的多肽区段，这类有序的非重复性结构经常构成酶活性部位和其他蛋白质特异的功能部位。相对于对照组，各膳食纤维干预组中胰淀粉酶的无规卷曲相对含量显著减小，其中，SDF（降低37.5%），尤其是DHPM-SDF（降低39.8%）引发的胰淀粉酶无规卷曲的相对含量下降最为显著（P＜0.05）。无规卷曲相对含量的减小可能是影响胰淀粉酶酶活力的主要二级结构是无规卷曲结构，在与刺梨纤维作用后，其无规卷曲区段受到较强的影响，致使酶活力发生显著性降低所致[30]。类似的，樊美慧[31]发现，酪氨酸酶与黄酮类化合物结合后，其酶活力降低、无规卷曲相对含量也发生显著降低，并且分子模拟实验发现黄酮类化合物与酪氨酸酶作用后，酶的无规卷曲构象发生改变，底物进入酶活性中心的通道受到了阻碍，最终导致酶活力受到抑制。故推测，刺梨果渣膳食纤维干预可能改变了胰淀粉酶的二级结构，并最终导致其活性降低。此外，根据图5、6的结果以及Ma Mengmei等[27]的报道，可推测DHPM处理使得SDF的粒径、功能基团的数量和裸露度均增加，DHPM-SDF与胰淀粉酶中酪氨酸、色氨酸等氨基酸残基间相互作用增强，从而使其对胰淀粉酶空间二级结构中的α-螺旋、无规卷曲的影响增强，导致DHPM-SDF对胰淀粉酶活力抑制能力增强。

3 结 论

刺梨果渣SDF、IDF、TDF都能通过吸附葡萄糖、抑制葡萄糖扩散以及影响胰淀粉酶二级结构来减缓葡萄糖的流动进程和降低淀粉消化速率。其中，与SDF相比，IDF表现出较强的葡萄糖吸附能力和抑制葡萄糖扩散的能力。SDF对胰淀粉酶活力的抑制能力显著高于IDF（P＜0.05），并且，SDF对胰淀粉酶活力的抑制可能是通过改变胰淀粉酶分子二级结构的α-螺旋和无规卷曲结构。TDF表现出于IDF相似的葡萄糖吸附能力和抑制淀粉酶活力能力。DHPM处理使得SDF的比表面积减小，平均粒径增大，颗粒阻碍作用增强，进而使DHPM-SDF表现出比SDF更强的葡萄糖吸附和抑制葡萄糖扩散的能力。此外，与SDF相比，DHPM-SDF通过显著增加胰淀粉酶中β-转角的相对含量以及降低α-螺旋和无规卷曲相对含量，而表现出更强的抑制淀粉酶活力的能力。本研究初步探索了刺梨果渣IDF、SDF和TDF以及DHPM-SDF对葡萄糖扩散和淀粉消化的影响，为刺梨果渣膳食纤维在淀粉消化过程中的调控作用及其降血糖活性研究提供理论依据，并为DHPM改性处理对刺梨果渣的精深加工提供技术参考。