短波紫外发光二极管处理对脂环酸芽孢杆菌的灭活效果及作用机制

翟娅菲，田佳丽，石佳佳，相启森，申瑞玲，王章存，李 可

（郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州 450001）

近年来，中国的果汁饮料市场发展快速，果汁饮料中丰富的维生素和生物活性化合物以及优良的口感成为其吸引消费者的主要原因[1]。但由脂环酸芽孢杆菌引起的果汁变质在美国、澳大利亚等国相继发生[2]。脂环酸芽孢杆菌是一种嗜酸、嗜热、非致病性的革兰氏阳性菌，能够通过产生孢子来度过不利于营养细胞生长的时期，传统的巴氏杀菌不能够使其完全灭活[3]。寻找合适的杀菌方式以有效灭活脂环酸芽孢杆菌一直在不断的探索中。

非热杀菌技术由于其杀菌过程中的低温特性，可以避免温度对食品造成的不良影响，不仅能有效灭活微生物，而且能较大程度地保留食品固有的特质[4-5]；因此，近年来在食品杀菌中备受关注。de Pascoli等[6]发现盾叶胡椒提取物可作为抑菌剂有效减少橙汁中初始脂环酸芽孢杆菌的数量。Porebska等[7]的研究表明，基于超高压和温热（50 ℃）联合处理的协同效应对苹果汁进行杀菌后，苹果汁中脂环酸芽孢杆菌孢子数量降低了3.7（lg（CFU/mL））。近年来出现的紫外杀菌技术也被认为在食品工业中具有广阔的应用潜力。2000年，紫外光已被美国食品药品监督管理局批准作为巴氏杀菌的替代方法来处理新鲜果汁产品[8]。此外，紫外光已被印度和瑞士等一些国家批准应用于食品加工过程[9]。紫外发光二极管照射是近年来新兴的一种非热杀菌技术，与传统的紫外汞灯相比具有可及时开关，无热辐射、无汞、体积小、寿命长以及可发射特定波长的光的优点，因此，在食品工业中具有更明显的应用潜力[10]。紫外发光二极管已经被应用于多种食品上多种微生物的灭活。使用波长为280 nm、照射剂量为720 mJ/cm2的短波紫外发光二极管（ultraviolet-C lightemitting diode，UVC-LED）分别处理苹果浊汁和苹果清汁，可使其中的Escherichia coliK12数量分别减少2、4.4（lg（CFU/mL））[11]。将波长为275 nm的UVC-LED应用于苹果汁和金枪鱼的微生物安全控制中，当照射剂量达到1 200 mJ/cm2时可使苹果汁中的鲁氏结合酵母降低5.64（lg（CFU/mL）），当照射剂量达到4 000 mJ/cm2时，可使金枪鱼表面的SalmonellaTyphimurium、Listeria monocytogenes以及Escherichia coliO157:H7数量分别减少1.31、1.86、1.77（lg（CFU/mL）），并且对苹果汁和金枪鱼的理化性质无明显影响[12-13]。

本课题组先前研究发现1 080 mJ/cm2UVC-LED（275 nm）处理可以有效灭活接种在橙汁中的脂环酸芽孢杆菌[14]，因此，本研究以纯培养体系中的脂环酸芽孢杆菌为研究对象，评价照射剂量对灭活效果的影响，以及相同照射剂量对处于不同生长阶段脂环酸芽孢杆菌的灭活作用，并通过分析蛋白、核酸的泄漏量，细胞膜的完整性，胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）累积水平以及处理后胞内蛋白质、DNA的损伤情况来探讨脂环酸芽孢杆菌的灭活机理，以期为UVC-LED在食品工业中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）DSM 3922 广东省微生物菌种保藏中心；BAT肉汤北京索莱宝科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、吖啶橙（acridine orange，AO） 生工生物工程股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UVC-LED设备（波长275 nm）由本实验室自制；NI-E荧光相差自动显微镜 日本尼康公司；UV-1500紫外分光光度计 上海美析仪器有限公司；Spark多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；BWS465-785S便携式拉曼光谱仪 美国B&W公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

将甘油管保存的脂环酸芽孢杆菌按照1%（体积分数）的接种量接种至50 mL BAT肉汤中，在45 ℃下摇床振荡培养（180 r/min，下同）29 h，取培养物于3 500hg下离心10 min，收集菌体。加入10 mL无菌生理盐水重悬菌体，3 500hg离心10 min后收集菌体，按此方法清洗3 遍，然后用无菌生理盐水将菌悬液浓度调整为106CFU/mL备用。

1.3.2 UVC-LED处理脂环酸芽孢杆菌

UVC-LED设备如图1所示，发射峰值为275 nm的UVC-LED灯以8 行8 列的形式排布在22 cmh22 cm的集成板上。UVC-LED照射剂量为照射功率/（mW/cm2）和处理时间/s的乘积[13]，单位为mJ/cm2。由于照射功率（450 mW/cm2）固定不变，通过改变处理时间来控制照射剂量。

图1 UVC-LED处理脂环酸芽孢杆菌示意图Fig. 1 Schematic diagram of UVC-LED treatment of A. acidoterrestris

将盛有20 mL菌悬液（106CFU/mL）的培养皿用不同剂量（0（未处理组）、10、20、30、40、50 mJ/cm2）UVC-LED进行照射处理，处理后的菌液用生理盐水进行梯度稀释（10、102、103、104），以未处理组为对照，选取100 µL各梯度的菌液均匀涂布于BAT固体培养基上，每个梯度设置3 个平行，45 ℃培养48 h进行菌落计数，每组实验重复3 次。

1.3.3 存活曲线的模拟

利用log-linear和Weibull模型对细菌的存活曲线进行动力学模拟[14]，log-liner模型见公式（1），Weibull模型见公式（2）。

式中：N为一定剂量UVC-LED处理后存活的细菌数量/（CFU/mL）；N0为处理前样品中细菌数量/（CFU/mL）；E为处理剂量/（mJ/cm2）；k为失活系数；D为微生物数量减少90%所需的处理剂量（mJ/cm2）；δ代表微生物数量减少90%所需的处理剂量/（mJ/cm2）；p为形状参数。

1.3.4 UVC-LED对处于不同生长阶段的脂环酸芽孢杆菌的灭活作用测定

参照文献[15]，将1.5 mL处于对数生长期的脂环酸芽孢杆菌培养液接种于50 mL BAT肉汤中，45 ℃下摇床振荡培养24 h，按照6%（体积分数）的接种量添加至300 mL新鲜BAT肉汤中，于45 ℃下摇床振荡培养。脂环酸芽孢杆菌在生长过程中会经历一段时间的迟缓期，逐渐进入对数期，最终达到稳定期。因此在2、4、8、12、16、24、29、32、36、39 h测定菌液600 nm波长处光密度值OD600nm；分别在2、4、24、29、32 h收集30 mL菌液，于3 500hg下离心10 min收集菌体，加入10 mL无菌生理盐水3 500hg离心10 min后收集菌体，按此方法清洗3 遍，用生理盐水将菌悬液浓度调整为105CFU/mL，取10 mL制备好的菌悬液于培养皿中，按照1.3.2节方法用20 mJ/cm2剂量的UVC-LED处理菌悬液并进行菌落计数，计算细菌的存活率（N/N0h100%）。

1.3.5 胞内核酸和蛋白质泄漏量的测定

分别取1 mL 1.3.2节不同剂量的UVC-LED处理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清液。用NanoDrop 2000超微量分光光度计分别在260 nm和280 nm波长处测定上清液的光密度值，计算核酸和蛋白质的泄漏量，单位为μg/mL。

1.3.6 细胞膜损伤程度测定

分别取1 mL 1.3.2节不同剂量的UVC-LED处理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min离心5 min，弃去上清液。加入1 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L、pH值为（7.2f0.2），后同）重悬菌体，4 ℃、12 000 r/min离心2 min后收集菌体，清洗两遍后重悬于800 µL的PBS中，加入200 µL PI染液（3 μmol/L），室温下避光反应15 min，然后12 000 r/min离心2 min收集菌体。加入1 mL PBS重悬菌体，4 ℃、12 000 r/min离心2 min后收集菌体，洗涤3 次以去除未反应的染液，最终将菌体悬于1 mL PBS中，在激发波长485 nm、发射波长635 nm条件下测定其荧光强度。细胞膜损伤程度以相对荧光强度表示，具体计算如公式（3）所示。

1.3.7 胞内ROS水平的测定

采用DCFH-DA荧光探针测定ROS水平。分别取1 mL 1.3.2节不同剂量处理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min离心5 min，弃去上清液。加入1 mL无菌PBS重悬菌体，4 ℃、12 000 r/min离心2 min后收集菌体，清洗两遍后重悬于800 µL PBS中，加入200 µL DCFH-DA染液（终浓度为10 μmol/L），37 ℃条件下避光反应30 min，4 ℃、12 000 r/min离心2 min后收集菌体。加入1 mL无菌PBS重悬菌体，4 ℃、12 000 r/min离心2 min后收集菌体，清洗两遍后重悬于1 mL PBS中。在激发波长为480 nm、发射波长为530 nm的条件下测定荧光强度，ROS水平以相对荧光强度表示，计算同式（3）。

1.3.8 脂环酸芽孢杆菌可溶性蛋白的测定

取对数期脂环酸芽孢杆菌培养液，按照6%（体积分数）的接种量添加至300 mL BAT肉汤中，45 ℃、180 r/min条件下培养29 h，离心（3 500hg、10 min）收集菌体并用生理盐水稀释到106CFU/mL。按照1.3.2节方法采用不同剂量UVC-LED处理脂环酸芽孢杆菌，4 ℃、3 500hg下离心10 min，收集菌体后再重悬于10 mL生理盐水中，400 W超声破壁10 min，每超声处理5 s间歇5 s。超声处理后6 000hg离心15 min，收集上清液即为细菌的可溶性蛋白溶液。采用便携式拉曼光谱分析细菌可溶性蛋白结构的差异，激发波长为785 nm，功率为80 mW，曝光时间为60 s，扫描次数为4 次，扫描范围400～2 000 cm－1。

1.3.9 胞内DNA损伤情况的观察

分别取1 mL 1.3.2节经0、30、50 mJ/cm2剂量UVC-LED处理后的菌液，离心（4 ℃、12 000 r/min，5 min）收集菌体，然后加入1 mL PBS于4 ℃、12 000 r/min离心2 min清洗菌体，重复清洗两遍后将菌体重悬于500 μL PBS中，加入500 μL AO染液（终质量浓度为0.1 mg/L），室温避光反应10 min，12 000 r/min离心2 min收集菌体，按上述条件（4 ℃、12 000 r/min离心2 min）用PBS清洗3 次去除未反应的染液，然后将菌体悬于200 μL PBS中，立即在荧光相差自动显微镜（40 倍物镜）下观察。

1.4 数据处理与分析

实验设置3 个平行，实验结果以平均值±标准差表示，数据均采用Excel软件进行处理，采用GraphPad Prism 9.0.0软件绘制柱状图，采用Origin 2018软件绘制曲线图。通过SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan多重比较进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 UVC-LED剂量对脂环酸芽孢杆菌的灭活效果

脂环酸芽孢杆菌的初始菌落数为6.0（lg（CFU/mL）），随着UVC-LED照射剂量的增加，脂环酸芽孢杆菌的存活数量逐渐减少（图2）。当照射剂量达到50 mJ/cm2时，可使存活的细菌数量降低4.6（lg（CFU/mL）），与Murashita等[16]研究结果相似，证明UVC-LED能够有效灭活细菌，剂量越大灭活效果越强。有研究表明，用UVC-LED处理冰中的SalmonellaTyphimurium、Listeria monocytogenes、Escherichia coliO157:H7，当紫外剂量达到40 mJ/cm2时可将Listeria monocytogenes完全灭活，而剂量增加到100 mJ/cm2时，SalmonellaTyphimurium和Escherichia coliO157:H7仍有存活[16]。由此可知，细菌类型会影响杀菌效果，微生物的生理状态包括细胞壁的厚度、细胞的大小、照射产生的光生成物以及DNA修复能力都会影响细胞对UVC-LED的敏感程度，进而造成灭活效果的差异[17-18]。

图2 UVC-LED处理下脂环酸芽孢杆菌的存活曲线Fig. 2 Survival curve of A. acidoterrestris treated by UVC-LED

存活曲线的模拟结果如表1所示，UVC-LED对生理盐水中脂环酸芽孢杆菌的杀灭作用既符合log-linear模型又符合Weibull模型，两个模型的R2均大于0.990 0。UVC-LED对橙汁中脂环酸芽孢杆菌的杀灭作用更符合Weibull模型[14]，且使细菌总量减少90%所需的照射剂量（39.36 mJ/cm2）也远大于生理盐水中所需的照射剂量（9.79、10.26 mJ/cm2），可能的原因为细菌所在基质的组成和理化特性对UVC-LED的杀菌存在影响[19]。因此，UVC-LED对不同基质中细菌的杀菌效果不同，还需更深入的具体研究。

表1 生理盐水中脂环酸芽孢杆菌经UVC-LED处理后的存活曲线模型及相关参数Table 1 Evaluation of survival curve models of A. acidoterrestris in saline solution after UVC-LED treatment

2.2 UVC-LED对不同生长阶段脂环酸芽孢杆菌的灭活作用

由图3可知，脂环酸芽孢杆菌在0～6 h间处于迟缓期，7～30 h为对数生长期，之后进入稳定期。由图3和表2可知，用相同剂量的UVC-LED处理不同生长时期的细菌，处于迟缓期和刚进入稳定期的菌体对UVC-LED处理的耐受性最强，存活率较高；而处于对数期的菌体对UVC-LED比较敏感，存活率相对较低，此时杀菌效果最好。钱静亚[20]在对枯草芽孢杆菌进行脉冲磁场处理时也发现，微生物处于不同生长阶段时对脉冲磁场处理的敏感性不同，处于对数期的枯草芽孢杆菌残留率较低。分析认为，处在不同生长阶段的脂环酸芽孢杆菌对于UVC-LED敏感程度不同，这与细菌自身的状态有直接的关系，细胞的生长与自身对环境的适应性密切相关。处于迟缓期的细菌，由于环境的突然改变使其基本呈现不生长的状态；适应环境之后细菌进入对数期，迅速繁殖生长；一段时间之后，由于环境中营养物质消耗以及代谢产物累积再次限制了细菌的生长，进入稳定期。一般当面对外部压力时，例如环境的改变，细菌会通过表达相关基因并降低细胞膜的流动性等方式进行损伤修复、保护或适应。这可能是迟缓期和刚进入稳定期时菌体对UVC-LED抵抗性增强的原因[15]。

图3 脂环酸芽孢杆菌的生长曲线Fig. 3 Growth curve of A. acidoterrestris

表2 不同生长时期脂环酸芽孢杆菌经相同剂量UVC-LED处理后存活率Table 2 Survival rates of A. acidoterrestris treated with the same dose of UVC-LED at different growth stages

2.3 UVC-LED处理对脂环酸芽孢杆菌胞内核酸和蛋白质泄漏量的影响

通过测定UVC-LED照射处理后胞内核酸和蛋白质的泄漏情况来评估脂环酸芽孢杆菌细胞膜通透性的变化。如图4所示，随着UVC-LED照射剂量的增加，细菌胞内核酸和蛋白质泄漏量呈显著增加趋势。由此说明，UVC-LED处理可以改变细胞膜的通透性，造成胞内核酸、蛋白质的泄漏。王哲[21]在对大肠杆菌进行UVC-LED处理时也有类似发现，短时间的照射破坏了大肠杆菌细胞膜以及细胞壁，造成核酸泄漏，OD260nm略有增加；同时在对处理3 min和5 min的大肠杆菌进行扫描电子显微镜观察中发现，细菌表面略有变形，但变化程度不大。细胞膜以及细胞壁的破损会导致内容物的流出，影响细胞活性，但是整体变化趋势较小，因此内容物的泄漏不足以成为UVC-LED致死细菌的主要原因。

图4 UVC-LED处理后脂环酸芽孢杆菌胞内核酸（A）和蛋白质（B）的泄漏量Fig. 4 Amounts of nucleic acid (A) and protein (B) leaked out of A. acidoterrestris cells after UVC-LED treatments

2.4 UVC-LED处理对脂环酸芽孢杆菌细胞膜的影响

PI具有不透膜性，对于未受损的细胞而言，PI不能够正常进入胞内，当细胞膜遭到破坏，PI进入胞内并与核酸结合在荧光下显现红色。因此，可通过测定UVC-LED照射后细胞内PI的相对荧光强度评估细胞膜的完整性。图5反映了不同照射剂量处理后脂环酸芽孢杆菌胞内PI的累积情况，照射后细胞的PI相对荧光强度显著高于未处理的细胞，不同剂量的处理对PI的相对荧光强度影响不显著。结果表明，照射处理对细胞膜完整性有一定程度的影响。据报道，波长不高于275 nm的紫外光能够破坏C－H键和C－C键[22]，因此，275 nm波长的紫外光处理能够损伤膜蛋白，从而破坏膜的完整性[23]。

图5 不同剂量UVC-LED处理后胞内PI相对荧光强度Fig. 5 Effect of UVC-LED treatments on relative fluorescence intensity of intracellular propidium iodide

2.5 UVC-LED处理对脂环酸芽孢杆菌胞内ROS水平的影响

如图6所示，脂环酸芽孢杆菌经低剂量的UVC-LED照射后，胞内ROS水平没有明显变化，当剂量提高到40、50 mJ/cm2时，其胞内ROS的水平略有提高，但与处理组仍不存在显著性差异（P＞0.05）。这些结果表明，UVC-LED照射处理没有造成细菌胞内ROS的累积，胞内的ROS不是造成细菌死亡的主要原因。Song Kai等[24]在用UVC辐照大肠杆菌的研究中加入相应的ROS清除剂，未观察到大肠杆菌死亡率的改变，说明UVC对大肠杆菌的灭活不涉及超氧自由基、羟自由基和过氧化氢等ROS的参与。研究表明，UVA主要被发色团的分子吸收，可产生氧化中间物如ROS，继而破坏蛋白、DNA以及细胞膜等，从而造成细菌死亡[25]，而UVC导致的细菌失活与ROS没有直接的关系。

图6 不同剂量UVC-LED处理对ROS水平的影响Fig. 6 Effect of UVC-LED treatment on ROS levels

2.6 UVC-LED处理对脂环酸芽孢杆菌可溶性蛋白的影响

经不同剂量UVC-LED处理后，细菌可溶性蛋白结构的差异可通过拉曼光谱反映，拉曼位移和强度的改变反映了蛋白二级结构及微环境的改变。未处理和经不同剂量UVC-LED处理后的菌体可溶性蛋白在400～2 000 cm－1范围内的拉曼吸收强度如图7所示。经UVC-LED处理后细菌可溶性蛋白的拉曼光谱存在差异。1 665 cm－1附近的酰胺I带和位于1 250 cm－1的酰胺III带能够间接反映蛋白质主链的结构，涉及蛋白质的二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲[26]。根据实验所得拉曼光谱图看出，经处理后两个谱带的吸收峰值发生一定变化。表明紫外光破坏了蛋白质分子结构，从而改变二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲的含量。谱线中特征峰大部分属于氨基酸谱线，呈现不规则的波动。侧链氨基酸的改变主要是微环境的变化引起的。经照射处理后的谱线在830 cm－1和850 cm－1附近酪氨酸残基的特征双峰中的峰值均高于未处理组，这可能是由于UVC-LED处理改变了菌体可溶性蛋白存在的微环境，使酪氨酸逐渐暴露。位于760 cm－1处色氨酸的峰值变化可以反映检测微环境的极性，有研究发现，色氨酸残基从疏水的环境中暴露于极性溶剂中，拉曼位移在760 cm－1处的强度会发生下降。图7谱线中经UVC-LED处理后760 cm－1处强度有所增加，表明在疏水环境中的色氨酸残基被进一步包埋，紫外照射使得微环境向非极性转变。1 450 cm－1附近脂肪族氨基酸峰值也有所提高，这归因于照射处理破坏了原来的聚集体，更多更小的聚集体的形成增加了疏水基团暴露[27-29]。整体而言，UVC-LED处理后菌体可溶性蛋白的拉曼强度发生波动，由于部分蛋白在280 nm波长处有吸收峰[21]，处理过程中菌体的蛋白结构吸收紫外光后发生不同程度的降解和重组，同时UVC-LED处理对菌体中蛋白所处的微环境产生了影响。

图7 UVC-LED处理后脂环酸芽孢杆菌可溶性蛋白拉曼光谱图Fig. 7 Raman spectra of soluble proteins of A. acidoterrestris treated with UVC-LED

2.7 UVC-LED处理对脂环酸芽孢杆菌的DNA损伤情况

AO能够透过细胞膜进入细胞并与DNA或RNA结合，在特定条件下呈现绿色或桔色荧光。未处理组中，细菌悬浮于生理盐水中处于静止期，与高效繁殖的细菌相比基本处于不活动的生理状态，此时核酸主要以DNA双链为主，AO与DNA双链结合后荧光颜色以绿色为主（图8）；UVC-LED处理组中，由于处理剂量的不同，荧光颜色呈现不同程度的橙色，经50 mJ/cm2的剂量处理之后，细菌呈现的荧光颜色以橙色为主。这说明UVC-LED处理造成了脂环酸芽孢杆菌DNA双链的断裂、变性及单链的产生，处理剂量越大，DNA双链的损伤程度越大[30]。分析认为，细胞内DNA由于其碱基能够直接吸收UVC而成为辐射的直接目标，导致DNA分子受到损伤。紫外处理过程中能够形成有毒物质（如环丁烷嘧啶二聚体、（6-4）光产物及其杜瓦价键异构体）、致突变性DNA损伤甚至造成DNA链断裂，如果不修复这种紫外线引起的损伤，最终会发生突变和细胞死亡[20,31-32]。UVC-LED处理脂环酸芽孢杆菌造成的DNA直接损伤程度较高，可能是引起细胞死亡的主要原因。

图8 不同剂量UVC-LED处理脂环酸芽孢杆菌AO染色后的荧光显微镜图像（×400）Fig. 8 Fluorescence microscopic images of AO stained A. acidoterrestris treated with different doses of UVC-LED (× 400)

3 结 论

研究证明UVC-LED能够有效灭活脂环酸芽孢杆菌，特别是处于对数生长期的细菌对UVC-LED处理更加敏感。UVC-LED处理增大了细胞膜通透性，导致胞内核酸和蛋白质出现一定程度的泄漏，胞内蛋白的结构有所改变，而与未处理组相比胞内ROS水平没有显著变化（P＞0.05）。AO染色后荧光分析结果表明UVC-LED对DNA双链结构产生影响，从而破坏微生物的生理功能，导致死亡。综上，UVC-LED主要通过损伤DNA来灭活脂环酸芽孢杆菌，本研究可为UVC-LED的应用提供理论参考。