抵当芪桂汤对2型糖尿病大鼠血糖和肝组织IRS-1、GSK-3β的影响*

韩思荣 屈杰 杨景锋 杨军 谭颖颖 李小会 陈丽名

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是胰岛素分泌不足和(或)胰岛素作用缺陷导致的一种以持续高血糖为主要临床表现的慢性代谢性疾病[1]。近年来，随着生活方式的改变和老龄化进程的加速，糖尿病患病人数迅速增长，已成为严重威胁人类健康的非传染类疾病。据统计数据显示：2019年全球的糖尿病患者人数已达4.63亿，中国约为1.298亿，跃居世界第一[2]。目前，T2DM的治疗手段包括口服降糖药物、注射胰岛素、控制饮食种类和数量及运动等，但T2DM及其并发症的控制效果不是非常理想[3]。

中医药在防治T2DM方面具有多靶点、多途径、个体化等不可替代的优势，它能够减缓西药不良反应，显著缓解临床症状，延缓并逆转并发症的发展进程[4]。通过大量的临床观察，导师杨景锋教授指出“气阴两虚，瘀血阻络”是T2DM的关键病机，并以益气养阴、活血通络作为T2DM的基本治疗法则，运用经方抵当汤和黄芪桂枝五物汤化裁组成抵当芪桂汤治疗T2DM，作用显著[5]。前期实验研究表明，抵当芪桂汤能够降低血糖，调节糖脂代谢紊乱，保护胰岛细胞[6]。本课题在其基础上研究抵当芪桂汤对2型糖尿病大鼠血糖及肝组织IRS-1、GSK-3β表达的影响，进一步探讨其降糖机制。

1 仪器与材料

1.1主要仪器 悦好Ⅲ型鱼跃血糖仪及配套血糖试纸(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；R136切片机(德国Leica)；CX21正置电子光学显微镜(日本OLYMPUS)。

1.2试药 抵当芪桂汤(由生黄芪30 g、桂枝10 g、酒大黄10 g、炒白芍15 g、水蛭6 g、鬼箭羽20 g组成)，中药材由陕西中医药大学校医院提供，品质合格。煎药取液，并浓缩成含生药0.948 g·mL-1和1.896 g·mL-1两种浓度，存储于4 ℃冰箱；盐酸二甲双胍(格华止)，中美上海施贵宝制药有限公司；链脲佐菌素(Streptozotocin)STZ，美国Sigma公司；HE染液，Servicebio；PAS染液，武汉谷歌生物科技有限公司；IRS-1、GSK-3β抗体，北京博奥森生物技术有限公司。

1.3实验动物 SPF级雄性SD大鼠80只，体质量(200±20)g，购于西安交通大学医学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK(陕)2007-001。

2 方法

2.1动物模型制备 80只SPF级雄性SD大鼠，适应性喂养1 w后，随机抽取10只作为空白对照组，给予普通饲料。剩下70只作为T2DM造模组，给予高糖高脂饲料，喂养6 w。第7 w，所有大鼠禁食12 h，对照组大鼠予按照35 mg·kg-1枸橼酸缓冲液进行腹腔注射，造模组大鼠按照35 mg·mL-1一次性腹腔注射STZ溶液(将STZ溶于0.1 mol·L-1、pH4.2的枸橼酸缓冲液，配制为1%浓度)。STZ注射72 h后，造模组大鼠尾静脉采血，测FBG≥16.9 mmol·L-1为造模成功。

2.2分组与给药 于STZ注射后的第8 d，将造模成功的60只大鼠按照随机数表分组(见表1)。药物干预6 w后，处死大鼠，留取血清、胰腺和肝组织。

2.3指标检测

2.3.1大鼠空腹血糖(FBG)的测定 测定FBG前禁食12 h，于大鼠尾静脉采血，用鱼跃血糖仪及配套血糖试纸检测。

2.3.2大鼠糖化血红蛋白(HbA1c)的测定 由陕西中医药大学第二附属医院检验中心采用全自动生化分析仪测定HbA1c含量。

2.3.3HE染色观察胰腺组织学变化 制作组织切片→脱蜡至水→苏木素染色→伊红染色→脱水封片→中性树胶封片。

2.3.4PAS染色观察糖原合成 制作组织切片→脱蜡至水→高碘酸染色→雪弗染色→苏木素染色→脱水封片。

2.3.5免疫组织化学法检测肝脏组织IRS-1、GSK-3β的表达 制作组织切片脱蜡至水→抗原修复→阻断内源性过氧化物酶→血清封闭→加一抗、二抗→DAB显色→复染细胞核→脱水封片，显微镜下观察IRS-1、GSK-3β的表达。

3 结果

3.1抵当芪桂汤对大鼠体重的影响 Control组大鼠体重呈现持续稳定增长。药物干预6 w后，与Model组比较，干预各组间大鼠体重的差异无统计学意义(P>0.05)；与Met组大鼠的体重相比，抵当芪桂汤各干预组组间差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2和图1。

图1 各组大鼠体重柱状图

表2 各组大鼠体重变化表

3.2抵当芪桂汤对大鼠空腹血糖(FBG)和糖化血红蛋白(HbA1c)的影响 与Control组相比，Model组大鼠的FBG、HbA1c均升高(P<0.01)；与Model组相比，Met组、DQZ组和DQZX组的FBG、HbA1c水平均呈现不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，与Met组相比，DQZ组的FBG、HbA1c水平差异无统计学意义(P>0.05)；DQZX组与药物干预各组相比，其HbA1c降低最为显著。见表3和图2。

表3 各组大鼠FBG、HbA1c水平

图2 各组大鼠FBG、HbA1c水平柱形图

3.3抵当芪桂汤对T2DM大鼠胰腺组织结构的影响 Control组：胰岛细胞多呈圆形或椭圆形细胞团，数量较多，结构完整清晰。Model组：胰岛细胞形态不规则，边界不清，数目明显减少，部分胰岛细胞肿胀、变形。与Model组比较，干预各组的胰岛组织结构、形态与数目均有不同程度好转，其中DQZX组：胰岛细胞形状较规则，细胞数量较多，细胞核分布均匀；DQZ组、Met组：胰岛细胞结构较为完整，细胞分布均匀；DQG组：胰岛细胞界限不清，分布不均，部分细胞核变形或消失，见图3。

图3 各组大鼠胰腺HE染色(10×40，Bar=100 μm)

3.4抵当芪桂汤对T2DM大鼠肝糖原合成的影响 Control组：糖原颗粒含量丰富，分布均匀。Model组：糖原颗粒明显减少，分布不均。与Model组相比，各药物干预组的糖原颗粒均呈现不同程度增加，分布相对均匀，其中DQZX组糖原颗粒数量最多，见图4。

图4 各组大鼠肝脏PAS染色(10×40,Bar=100 μm)

3.5抵当芪桂汤对T2DM大鼠肝组织IRS-1、GSK-3β蛋白表达的影响 IRS-1：与Model组比较，Met组、抵当芪桂汤各组的表达均显著升高(P<0.01)；与Met组相比，DQG组较低，DQZX组较高(P<0.01)。

GSK-3β：与Model组比较，Met组、抵当芪桂汤干预各组表达均降低(P<0.05或P<0.01)；与Met组相比，DQG组较高，DQZX组较低(P<0.05或P<0.01)。结果见图5、6、7。

图5 各组大鼠肝组织IRS-1蛋白表达图

图6 各组大鼠肝组织GSK-3β蛋白表达图

图7 干预6周后各组大鼠IRS-1、GSK-3β的表达柱状图

4 讨论

中医学认为，阴虚燥热是消渴的主要病因病机，治疗多以养阴清热生津为主。但是杨景锋教授基于经典理论和多年临床经验，发现T2DM多见于中老年患者，多伴有肥胖、高血压、心脑血管病等基础疾病，久病多虚、多瘀，气虚血瘀情况较为多见，提出T2DM的主要病因病机为“气阴两虚，瘀血阻络”，以益气养阴、活血通络作为其基本治则治法，将经方抵当汤与黄芪桂枝五物汤加减组成抵当芪桂汤用于T2DM及其并发症的治疗，临床疗效显著。抵当芪桂汤以黄芪、炒白芍为君药，益气养阴生津；桂枝温通经络，水蛭、酒大黄活血化瘀，共为臣药；并以鬼箭羽为佐，破血祛瘀。诸药合用，补益而不郁滞，祛瘀而不伤正，共奏益气养阴、活血通络之效。药理研究表明抵当芪桂汤中的药物能够调节糖脂代谢紊乱，保护胰岛细胞，刺激胰岛素分泌，增强葡萄糖的摄取和利用，降低血糖水平[7-13]。

肝糖原的合成与分解是人体调控血糖水平的重要环节，其合成减少或者分解增加均会使血糖居高不下[14]。正常生理状态中，肝糖原的合成与分解受胰岛素的调控，处于平衡状态[15]。当胰岛素分泌减少或其敏感性下降，肝糖原合成会减少，糖代谢紊乱，导致血糖升高。而胰岛素受体底物1(IRS-1)是胰岛素信号传递的首要蛋白分子，主要参与肝脏调节葡萄糖代谢、胰岛素分泌及其信号传导等过程，其表达下降，胰岛素敏感性随之降低，胰岛素信号传递受到阻滞，影响其信号传导的强度，从而会影响肝脏利用葡萄糖的能力，导致T2DM的发生[17-18]。糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是调控糖原合成的关键酶，有两种异构体GSK-3α和GSK-3β，GSK-3β效应居多[19]。当胰岛素作用于PI3K/Akt通路，GSK-3β与活化后的Akt结合，GSK-3β活性受到抑制，其底物糖原合成酶(GS)则升高，促进糖原合成，从而降低血糖。

本实验通过高糖高脂饲料联合腹腔注射小剂量的STZ建立T2DM大鼠模型[20-21]，实验结果表明抵当芪桂汤能够有效降低T2DM大鼠的血糖水平，保护其胰岛细胞，并上调IRS-1表达，下调GSK-3β的水平。提示抵当芪桂汤可能通过调控IRS-1和GSK-3β的水平，增强胰岛素信号传导，促进肝糖原合成，保护胰岛细胞，从而发挥降糖作用。且当二甲双胍与抵当芪桂汤联合治疗T2DM时，可增强其降糖疗效。