抗番茄黄化曲叶病毒病基因ty-5的功能标记开发与利用

邹虎成 李玉洪 覃柳兰 庄映红滕献有 潘玲华

（桂林市农业科学研究中心，广西农业科学院桂林分院，广西桂林 541006）

近年来，由番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起的病害是造成番茄减产的重要病害之一（Zhang et al.，2009；张前荣等，2017；胡荣 等，2020），因此选育抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄品种很有必要，而利用抗病基因培育抗病品种是防治番茄黄化曲叶病毒最有效的策略（Palumbo et al.，2001；Lapidot &Friedmann，2012；Polston，2014；刘微 等，2018）。目前国内外选育的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄品种以含有抗性基因-（宋建军 等，2011；葛乃蓬 等，2014；周明 等，2020）、-（刘梦姣 等，2018；赵丽萍 等，2018）、-（杨悦俭 等，2011）和-（杨晓慧 等，2012）为主，而-对番茄黄化曲叶病毒病具有很高的抗性，对抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄育种具有重要意义（王银磊 等，2014）。秘鲁番茄（）TY-172携带1 个抗番茄黄化曲叶病毒的隐性基因-，其位于第4 号染色体，定位在425 bp 的区域（Anbinder et al.，2009；Hutton et al.，2012；Sade et al.，2012）；开发已经克隆的-基因的功能性分子标记对选育含抗病基因-的番茄品种具有重要的应用价值。

目前，对-基因克隆、数量性状位点（QTLs）以及从SSR（simple sequence repeats）标记库中筛选获得的与-基因紧密连锁的分子标记很难在番茄材料育种上得到应用。其原因是，一方面，即使目前分子标记技术的第3 代测序已经成熟，但是非自动化PCR 扩增与其检测方法受到人力和物力的制约，很难全面地应用于分子标记辅助育种（Andersen &Lubberstedt，2003；贺道华 等，2009）；另一方面，这些分子连锁标记只能检测出种质资源是否含有与分子标记连锁的基因，无法对基因的功能变化做出相应的分子检测验证，如杨欢欢等（2015，2016）筛选出与-基因紧密连锁的SSR 标记，可利用此标记检测番茄新品种中是否导入了抗番茄黄化曲叶病毒病基因-，但-基因会因环境变化而发生序列突变，进而改变-基因的抗性；如继续用此SSR 标记进行含抗番茄黄化曲叶病毒病-基因新品种的分子选育，就失去了原有育种目标与意义。

功能标记近年来已在很多作物中有应用报道，如水稻垩白基因功能标记的开发与应用（朱金燕 等，2017），水稻粒形相关变异位点的功能标记开发及其应用（王鸣森，2015），水稻稻瘟病基因-的共显性功能标记的开发与利用（李永聪等，2019），大豆耐盐相关基因功能标记的开发与验证（宁丽华 等，2017），白菜类作物开花时间相关基因的克隆及功能标记开发（刘东让 等，2019），等等。但目前关于抗番茄黄化曲叶病毒病-基因功能标记的开发与应用的研究鲜见报道。本试验针对-基因编码序列的功能性SNP 突变位点开发1 个-基因的功能标记，以期为定向改良番茄品种对番茄黄化曲叶病毒病的抗性提供分子辅助育种手段。

1 材料与方法

1.1 材料

供试番茄材料为番茄黄化曲叶病毒病抗病自交系t33-14、感病自交系t2301、t33-14 ×t2301 的F株系，以及不同来源的26 份番茄材料AZC1～AZC9、BZC1～BZC6、CZC12～CZC17、DZC1～DZC5，均由桂林市农业科学研究中心蔬菜所番茄课题组选育、收集与保存。

1.2 番茄黄化曲叶病毒病抗病性鉴定

利用温室集体接种法进行病毒接种。每份材料种植30 株，当温室内温度为25～30 ℃，番茄幼苗3～4 片真叶时，每天驱虫2 次使其均一受毒，接种30 d 后调查发病情况，并取样（叶片）提取DNA。抗病性鉴定期间，不使用杀虫剂。病情级别分为0～4 级：0 级，无明显症状；1 级，叶片只表现有黄色斑点或斑驳症状；2 级，叶片黄化，比正常植株略微矮小且轻微变形；3 级，植株矮化，叶片变小、卷曲且边缘黄化；4 级，植株严重矮化，叶片皱缩、黄化、卷曲并导致叶片面积大大减小。0～1 级归为抗病，2～4 级归为感病（彭祥珍，2012）。

1.3 序列比对

Lapidot 等（2015）研究表明在-基因的编码区域，存在1 个碱基替换的情况，其第47 位点处的碱基T 被替换为G，从而导致翻译的蛋白质由缬氨酸转变为甘氨酸，对番茄黄化曲叶病毒病由感病变为抗病。根据Lapidot 等（2015）提供的-基因登录号kc447285，在NCBI 上查找到-基因的编码序列，并在NCBI 上进行blast 比对，得到了6 个-基因在对应6 个番茄种质资源（LA0441、PI126926、PI126930、PI390681、TY172 和M82）上的转录本（NCBI 上的登录号分 别 为kc567256.1、kc567249.1、kc447285.1、kc567254.1、kc567248.1 和kc447288.1）以及6个转录本翻译的氨基酸序列（NCBI 上的登录号分别为agl43089.1、agl43082.1、agj52120.1、agl43087.1、agl43081.1 和agj52123.1）。将上述6个-基因转录本和6 个转录本翻译的氨基酸序列，在DNAMAN 软件上分别进行基因和氨基酸序列比对。

1.4 DNA 提取和PCR 扩增

采用CTAB 法提取番茄基因组DNA（王关林 和方宏筠，2002）。PCR 反应体系为20 μL：2.0 μL 的10 × PCR buffer、0.5 μL 的10 mmol·LdNTPs、1 μL 的10 μmol·L的Ty-5-f1 引物、1 μL 的10 μmol·L的Ty-5-f2 引 物、1 μL 的10 μmol·L的Ty-r引物、0.2 μL的DNA聚合酶、1.5 μL 的模板DNA 和12.8 μL 的ddHO。PCR 反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33 个循环；最后72 ℃延伸5 min。

1.5 番茄材料功能标记验证

将TySNP 功能标记扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测，银染完毕后，记录带型，感病杂合材料扩增的片段大小为119 bp/114 bp，并与番茄表型抗病性进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 序列分析

序列比对结果显示（图1），番茄材料LA0441、PI126926、PI126930、PI390681、TY172和M82 的-基因编码区域的第47 位点处的碱基为T，使翻译蛋白质为缬氨酸（V），而番茄材料TY172 的-基因编码区域的第47 位点处的碱基为G，使翻译蛋白质为甘氨酸（G），与Lapidot 等（2015）的研究结果一致。因此开发-基因表型变异的功能性突变位点（G/T）的功能标记对番茄黄化曲叶病毒病抗病品种的分子选育具有重要应用价值。

图1 6 份番茄材料的ty-5 基因编码序列（a）与氨基酸序列（b）片段的比对

2.2 ty-5 基因功能标记的开发及检测

本试验在-基因功能性SNP 突变位点（G/T）及所在的基因编码序列上设计功能标记的3 条引物：1 条公共的反向引物和2 条扩增等位基因的正向引物，即TySNP-r 和TySNP-f1、TySNP-f2；并在-基因功能性SNP 突变位点（G/T）处的倒数第2 个或者第4 个碱基处进行人为的错配，TySNP-f1 由G 错配为A；TySNP-f2 由G 错配为C（图2-a）。

图2 TySNP 功能标记的开发和检测

利用TySNP 功能标记对抗病自交系t33-14 和感病自交系t2301 进行基因型检测。结果显示（图2-b），TySNP 功能标记在抗病自交系t33-14 中扩增的-基因片段大小为114 bp，与标记设计的大小一致，表明该番茄材料-基因编码区域的第47 位点处的碱基为G，-基因功能正常，具有对番茄黄化曲叶病毒病的抗性；感病自交系t2301 扩增的-基因片段大小为119 bp，与标记设计的大小一致，表明该番茄材料-基因编码区域的第47 位点处的碱基为T，-基因编码区域发生碱基替换，对番茄黄化曲叶病毒病由抗病变为感病。

2.3 ty-5 基因功能标记的验证

利用本试验开发的功能标记TySNP 对番茄黄化曲叶病毒病抗病自交系t33-14 与感病自交系t2301 及其杂交F分离群体后代株系进行基因型鉴定（图3），其中tf2-10、tf2-17 鉴定为抗病材料，tf2-4、tf2-7、tf2-8、tf2-15、tf2-16 为感病材料。将基因型与表型抗病性进行相关性分析，可知功能标记TySNP 抗病基因型有56 份，其中38 份表型鉴定为抗病，18 份为感病；功能标记TySNP 感病基因型有96 份，其中83 份表型鉴定为感病，13 份为抗病。总体上看，152 份F分离群体中有121 份（80%）标记基因型与表型一致，31 份（20%）与表型不一致。经卡平方测验，χ=2.834 ＜χ=3.84。因此，功能标记TySNP 对t33-14 × t2301 的F分离群体抗感病的相关性达到显著水平（表1）。

表1 t33-14×t2301 的F2 分离群体功能标记TySNP 基因型与抗病性的相关性分析

图3 功能标记TySNP 在父母本及部分F2 株系中的电泳检测结果

2.4 利用ty-5 基因功能标记对番茄黄化曲叶病毒病抗性的鉴定

对番茄黄化曲叶病毒病抗病自交系t33-14、感病自交系t2301 以及不同来源的26 份番茄材料田间（表型）调查结果和利用本试验开发的功能标记TySNP 对番茄黄化曲叶病毒病抗性鉴定结果见表2。结果表明，自交系t33-14 表型鉴定结果为抗病，基因型跟表型吻合；自交系t2301 表型鉴定结果为感病，基因型跟表型吻合；AZC1、AZC2、AZC5、AZC6、AZC9、BZC1、BZC4、CZC12、DZC1、DZC3 和DZC5 扩增的-基因片段大小跟番茄黄化曲叶病毒病抗病自交系t33-14 一致，片段长度为114 bp，表明该12 份番茄材料为黄化曲叶病毒病抗病纯合基因型，番茄黄化曲叶病毒病表型鉴定结果为抗病，基因型跟表型吻合；AZC4、AZC7、BZC5、BZC6、CZC13、CZC14、CZC15和DZC2 扩增的-基因片段大小跟番茄黄化曲叶病毒病感病自交系t2301 一致，片段长度为119 bp，表明该9 份番茄材料为黄化曲叶病毒病感病纯合基因型，番茄黄化曲叶病毒病表型鉴定结果为感病，基因型跟表型吻合；由于-基因属于隐性基因，AZC3、AZC8、BZC2、BZC3、CZC16、CZC17 和DZC4 扩增的片段长度为119 bp/114 bp，表明该7 份番茄材料为感病杂合基因型，番茄黄化曲叶病毒病表型鉴定结果中AZC3、AZC8、CZC16、CZC17 和DZC4 为感病，基因型跟表型吻合，而BZC2、BZC3 为抗病，表明材料可能含有除-以外的其他抗黄化曲叶病毒的抗性基因。因此，功能标记TySNP 能够准确地区分番茄黄化曲叶病毒病抗病材料和感病材料的纯合基因型以及感病杂合基因型，且不同的基因型跟表型能较好地对应吻合。

表2 利用功能标记TySNP 鉴定28 份番茄材料基因型及其与田间鉴定结果比较

3 结论与讨论

分子标记辅助选择育种能有效提高对目的基因和性状的选择效率，开发抗番茄黄化曲叶病毒病基因-紧密连锁的分子标记可以加快番茄抗病育种进程。近年来，相继报道了抗性基因-的分子连锁标记被开发与利用，如姜静等（2017）设计了-基因的分子连锁标记ty-5-17，可用于抗TYLCV 番茄品种的分子辅助育种，但是由于在遗传过程中基因重组而导致重要遗传信息的丢失及连锁累赘的问题，且容易受到环境条件的影响，很难在育种上得到应用；姚祝平等（2015）设计了-基因的CAPS 标记，但在检测大批量基因型时，需要酶切，成本较高，费时、费力。相比于传统的连锁分子标记和其他类型标记，功能标记是基于基因内部序列变化引起表型变异的一种分子标记，其和性状完全连锁，具有很大的优越性，可直接利用而不需要对世代群体作图，从而在一定程度上避免了由于遗传过程中的基因重组而导致重要遗传信息的丢失及连锁累赘的问题，功能标记无需酶切，省时、省力、简单且节约成本（贺道华 等，2009）。

本试验针对-基因编码序列的功能性SNP突变位点（G/T）（Lapidot et al.，2015）开发了1个功能标记TySNP，并对番茄黄化曲叶病毒病抗病自交系t33-14、感病自交系t2301，及其杂交F株系和不同来源的26 份番茄材料进行基因型鉴定，结果表明番茄黄化曲叶病毒病抗病自交系t33-14扩增的-基因片段大小为114 bp，表型鉴定结果为抗病，基因型与表型吻合；感病自交系t2301 扩增的-基因片段大小为119 bp，表型鉴定结果为感病，基因型与表型吻合。152 份F分离后代中有121 份（80%）标记基因型与表型一致。经卡平方测验，功能标记TySNP 与t33-14 × t2301 的F分离群体抗感病的相关性达到显著水平。

不同来源的26 份番茄材料中，11 份番茄材料为黄化曲叶病毒病抗病纯合基因型，表型鉴定结果为抗病，基因型与表型吻合；8 份番茄材料扩增的-基因片段大小与感病自交系t2301 一致，片段长度为119 bp，为番茄黄化曲叶病毒病感病纯合基因型，表型鉴定结果为感病，基因型与表型吻合；由于-基因属于隐性基因，7 份番茄材料扩增片段长度为119 bp/114 bp，为感病杂合基因型，表型鉴定结果中AZC3、AZC8、CZC16、CZC17和DZC4 为感病，基因型跟表型吻合，而BZC2、BZC3 为抗病，表明材料可能含有除-以外的其他抗TYLCV 的抗性基因。

综上所叙，功能标记TySNP 能准确地区分和鉴定育种亲本以及杂交后代群体的番茄黄化曲叶病毒病抗病材料纯合基因型、感病材料纯合基因型以及感病杂合基因型，且不同的基因型跟表型能较好对应吻合，可对杂交后代进行有效选择，为定向改良番茄品种黄化曲叶病毒病的抗性提供分子标记辅助育种手段。