分子标记筛选抗马铃薯Y 病毒种质资源研究

蒋 伟 卢丽丽 包丽仙 李秀芬，2 杨绍英，3 杨荣凯 杨美青 李先平*

（1 云南省农业科学院经济作物研究所，云南昆明 650205；2 云南省文山州砚山县八嘎乡农业综合服务中心，云南文山 663109；3 云南省玉溪市峨山县化念镇农业农村综合服务中心，云南玉溪 653203；4 云南省德宏州盈江县农业农村局农业技术推广中心，云南德宏 679300；5 包头医学院药学院，内蒙古包头 014040）

病毒病是危害马铃薯健康生产的重要病害，特别是马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）。马铃薯感染PVY 后一般减产50%左右，当其与马铃薯X 病毒（PVX）或马铃薯A 病毒（PVA）复合侵染时，减产可达80%。PVY 不仅能降低马铃薯的产量，还严重影响马铃薯的品质，是种薯退化的主要原因（Wang et al.，2011；沈林林 等，2016）。马铃薯抗病毒育种能有效控制病毒病对马铃薯的危害，是解决马铃薯病毒病危害、促进马铃薯产业发展的有效手段（Solomon-Blackburn &Barker，2001a；王晓明 等，2005）。病毒的进化速度比较快，已被鉴定命名的PVY 株系至少有7 类（Singh et al.，2008）。随着马铃薯抗病毒基因的克隆及抗性遗传研究发展，开发分子标记筛选及聚合多个抗性基因的马铃薯种质已成为一种有效的育种策略（Solomon-Blackburn &Barker，2001b；聂碧华，2010）。通过传统育种方法将多个抗不同病毒或其他病害的抗性基因聚合到一个马铃薯品种中是非常困难且非常耗时的，分子生物学技术（如分子标记辅助育种）的运用可以大大缩短育种进程，快速有效地融合多个目标性状（Solomon-Blackburn &Barker，2001b）。

目前已发现3 个马铃薯Y 病毒抗性基因Ry（Munoz et al.，1975）、Ry（Cockerham，1943）和Ry（Asama et al.，1982），能 够 对PVY 所 有生理小种产生极端抗性。为了检测马铃薯资源中是否含有这些抗性基因，已开发多个分子标记用于抗病毒马铃薯品种分子辅助育种，其中ADG2BbvI、RYSC3 和RYSC4 用于检测抗性基因Ry（Hämäläinen et al.，1998；Sorri et al.，1999；Kasai et al.，2000；刘程 等，2021）。因RYSC3 只需要一次PCR 而且准确率高，被广泛用于Ry的 检测（Kasai et al.，2000；Ottoman et al.，2009；Ortega &Lopez-Vizcon，2012；Fulladolsa et al.，2015）。SSR 标 记STM0003（Song et al.，2005）和STS 标记YES3-3A、YES3-3B（Song &Schwarzfischer，2008）用于检测Ry。YES3-3A可以有效地检测马铃薯品种Barbara 及其后代的PVY 极端抗性（Nie et al.，2016）。分子标记Ry186和Ry364 用于检测Ry极端抗性（Hosaka et al.，2001；Mori et al.，2011）。

分子标记辅助育种在发达国家的抗病毒育种中开展比较早且研究比较深入。如Whitworth 等（2009）利用分子标记RYSC3、RYSC4 和ADG2成功鉴定了抗PVY 的亲本来源，同时准确鉴定出后代分离群体中具极端抗性的个体，加速了抗性品种的筛选并为下一步育种亲本的选择提供了重要的参考。Fulladolsa 等（2015）利用与PVY 抗性基因Ry和Ry紧密连锁的分子标记RYSC3 和YES3-3B 从46 个品种和品系中鉴定出19 个抗性株系。我国在马铃薯病毒病抗性资源分子育种方面起步较晚且报道较少。赵兴涛（2012）利用RYSC3 对国内190 个主要育成品种和699 个国外引进育种资源进行快速鉴定，发现国内品种中22 个品种、国外引进资源中202 份资源含有Ry。白磊和郭华春（2017）利用RYSC3 对140 份马铃薯资源进行检测，发现28 份资源中含有Ry。综上可知，RYSC3 和YES3-3A 广泛用于Ry和Ry的检测。为了进一步验证这2 个分子标记的准确性和筛选可利用的抗性资源材料，本试验以云南省农业科学院从美国引进的亲本含有Ry或（和）Ry基因的9 个薯条加工型杂交组合为试验对象，利用RYSC3和YES3-3A 筛选含有Ry和Ry的抗性资源，并通过人工接种PVY 来验证分子标记预测的准确性，同时结合田间表现，开展连续两年的产量评价，筛选具有PVY 抗性且产量高的材料作为薯条加工型马铃薯品种选育的亲本材料或候选品种。

1 材料与方法

1.1 材料来源和种植

供试材料为云南省农业科学院引自美国的9 个薯条加工型马铃薯杂交组合，这些杂交组合至少有1 个亲本含有PVY 抗性基因（表1），共包含852个株系。2018 年3 月26 日，在云南省农业科学院嵩明科研基地温室内，将实生种子播种在育苗盘内，4 月24 日移栽到16 cm × 14 cm 的花盆中，期间进行正常的水肥管理。1 个月后采集新鲜的叶片提取DNA，用于后续抗性基因分子标记的检测。同年8 月，单株收获作为后续人工接种PVY 评价和田间评价的材料。

表1 从美国引进的薯条加工型马铃薯杂交组合信息

1.2 分子标记鉴定供试材料的PVY 抗性

采用新型植物基因组DNA 提取试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕提取供试样品基因组DNA，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量。检测抗性基因Ry的分子标记采用RYSC3，其引物序列为正向5′ATACACTCATCTAAATTTGATGG 3′，反向5′AGGATATACGGCATCATTTTTCCGA 3′，产物大小为321 bp（Kasai et al.，2000）。检测抗性基因Ry的分子标记采用YES3-3A，其引物序列为正向5′TAACTCAAGCGGAATAACCC 3′，反向5′AATTCACCTGTTTACATGCTTCTTGTG 3′，产物大小为341 bp（Song &Schwarzfischer，2008）。PCR 扩增体系为15 μL，包括2×PCR 预混试剂7.5 μL，正反向引物各0.3 μmol·L，DNA 模板为10 ng，用双蒸水补齐至15 μL。PCR 扩增后的产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3 PVY 接种鉴定验证供试材料的PVY 抗性

Ry和Ry对所有PVY 株系都具有抗性，为了验证分子标记检测结果的准确性，选取179 份材料进行PVY 人工接种，接种毒株为PVY型，检测病毒侵染情况。2019 年3 月，在云南省农业科学院嵩明基地温室内种植待接种材料，每份材料播种3 盆，以感病品种底希瑞（Desiree）作为阳性对照。待马铃薯幼苗具有4～5 片真叶时，采用人工机械摩擦方法接种。接种缓冲液为0.1 mol·L磷酸缓冲液，pH 为7。采集PVY毒株叶片10～15 g，加入20～30 mL 磷酸缓冲液，在研钵中充分研磨，用纱布过滤研磨的汁液。在待接种材料的第4 片展平的真叶表面撒上金刚砂（600 目），用棉签蘸取毒株汁液在叶片表面来回涂抹。接种3 周后开始取样，取接种植株新生叶片3～4 片，放于自封袋中于-80 ℃保存。待所有样品采集完后，进行DASELISA 血清学检测。

1.4 供试材料田间产量评价

将检测含有抗性基因分子标记的材料于2019、2020 年3—10月连续两年种植在云南会泽县驾车乡钢厂村（25°52′2.88″N，103°18′12.80″E）进行田间产量评价。每份材料种植5 株，株距30 cm、行距60 cm。种植期间进行正常田间管理。收获时统计收获株数、薯块数目，并称重。利用Excel 进行数据整理分析。

2 结果与分析

2.1 分子标记鉴定供试材料的PVY 抗性结果

马铃薯PVY 抗性基因Ry连锁分子标记RYSC3 和Ry连锁分子标记YES3-3A 的PCR扩增条带如图1 所示。由表2 可知，4 个杂交组合后代中163 个株系含有分子标记RYSC3，占比19.13%，分别是A07748（40 个株系，占比48.19%）、A08465（32个株系，占比53.33%）、A11784（30 个株系，占比62.50%）和A12340（61个株系，占比50.00%）；7 个杂交组合后代中330个株系含有分子标记YES3-3A，占比38.73%，分别是A07781（54 个株系，占比43.20%）、A08419（16个株系，占比59.26%）、A08474（44 个株系，占比51.76%）、A11783（47 个株系，占比40.17%）、A11784（25 个株系，占比52.08%）、A12312（94个株系，占比50.81%）和A12340（53 个株系，占比43.44%）。其中A11784 和A12340 后代中共42个株系同时检测到2 种分子标记。

图1 杂交组合A12340 后代中不同株系分子标记RYSC3 和YES3-3A 检测结果

表2 9 个杂交组合后代中检出RYSC3、YES3-3A 分子标记的株系数目及比例

2.2 PVY 接种鉴定与分子标记预测综合分析

共接种鉴定179 个株系，其中165 个株系含有基因连锁分子标记，14 个株系不含分子标记（表3）。结合ELISA 检测PVY 接种株系的结果进行综合分析，9 个杂交组合中阳性预测率（即含有基因连锁标记的株系中，通过接种鉴定确定具有PVY 抗性株系的概率）为80.00%～100.00%，A11784 的阳性预测率最低，为80.00%，A08419、A08465、A08474 和A12340 的阳性预测率最高，达到100.00%；9 个杂交组合平均阳性预测率为92.73%。阴性预测率（即不含有基因连锁标记的株系中，通过接种鉴定确定不具有PVY 抗性株系 的概 率）为0～100.00%，A07748、A07781、A08474、A11784 和A12340 后代中经检测不含抗性标记的株系，但接种鉴定表现为抗病，故阴性预测率为0；A08465 和A11783 后代中经检测不含抗性标记的株系，接种鉴定均表现为感病，阴性预测率为100.00%；8 个杂交组合（未取A08419 后代中不含抗性标记的株系进行接种鉴定）平均阴性预测率为28.57%。

表3 9 个杂交组合后代接种鉴定材料及结果分析

2.3 田间产量评价

对372 份含有抗性基因分子标记的材料进行两年的产量评价，结果表明（表4），这些材料平均单株结薯数为4.11 ± 2.34 个，变幅为0.25～17.30 个，变异系数为0.57；平均单株产量为0.31 ± 0.21 kg，变幅为0.01～1.47 kg，变异系数为0.68。A11783平均单株结薯数最多（5.26 ± 2.44 个），A08419平均单株结薯数最少（3.28 ± 1.53 个）；A08465（0.35 ± 0.29 kg）、A11783（0.35 ± 0.24 kg）和A12340（0.35 ± 0.23 kg）平均单株产量较高，A08474 平均单株产量最低（0.27 ± 0.19 kg）。根据单株产量及两年产量的稳定性（变异系数），筛选出10 份产量高、变异系数小的株系材料作为候选品种或亲本材料（表5），即A11784-7、A12340-6、A12340-7、A11784-37、A12312-53、A12340-41、A08474-58、A11783-108、A12312-55和A11784-29。

表4 9 个杂交组合后代单株结薯数和产量

表5 筛选获得的10 份薯条加工型马铃薯材料产量相关指标

3 讨论与结论

利用分子标记筛选具有PVY 抗性的马铃薯资源，可以在马铃薯品种选育的早期快速筛选到携带PVY 抗性基因的杂交组合后代，为抗病育种提供优良的材料。本试验以引自美国的薯条加工型马铃薯杂交组合后代为试材，并结合其亲本PVY 抗性基因信息，通过对抗性基因连锁的分子标记筛选，在品种选育早期选择含有PVY 抗性的后代进一步筛选。研究结果表明，结合亲本谱系信息，分子标记筛选的效率更高（Slater et al.，2014），如杂交组合A11784 和A12340，其双亲含有2 种抗性基因Ry和Ry，所以在其42 个后代株系中检测到2种分子标记。

PVY 抗性由单个显性基因控制（Fulladolsa et al.，2015），且基因位于着丝粒远端（Hämäläinen et al.，1998；Song &Schwarzfischer，2008）。由于检测的杂交组合为同源四倍体，染色单体分离过程更加复杂，如基因与着丝粒之间发生交叉（Elison et al.，2020）。因此，检测的杂交组合A11784 后代 中RYSC3+∶RYSC3-和A07781、A11783、A12340 后代中YES3-3A+∶YES3-3A-的分离比偏离1∶1（表2）。理想的分子标记应该与目的性状精准匹配，但是目前植物育种中所使用的大部分分子标记都不理想（Park et al.，2018）。RYSC3 和YES3-3A 是检测PVY 抗性基因Ry和Ry常用的分子标记，本试验检测的9 个杂交组合中有4 个组合分子标记筛选携带抗PVY 基因，与人工接种鉴定结果100%吻合，其余5 个组合出现不同比例假阳性预测结果（表3），可能是由于基因与分子标记发生了重组，而71.43%未携带标记的株系表现出抗病性状即假阴性。Ottoman 等（2009）的研究结果表明，接种后取样时间对检测结果影响比较大，接种后20 d 取样检测，仅46%的样本两种检测结果相对应，即含有抗性基因分子标记的样本ELISA 检测呈阴性，而不含有抗性基因分子标记的样本ELISA 检测呈阳性；接种后40 d 取样检测，86%的样本在两种检测中表现一致。本试验的取样时间为接种后3 周（即21 d），因此，可能取样时间偏早导致分子标记鉴定结果与人工接种后ELISA 鉴定结果偏差稍大。除此之外，本试验对感病的判定标准较为严格，3 个重复中有1 个重复检测出感病即判定该样本不抗病，因此尽管Ry和Ry对所有PVY 株系都具有抗性，但仍有携带抗性标记的个体检测出感病。本试验共接种鉴定179个株系，其中含有分子标记的样本（165 个）是不含有分子标记样本数目（14 个）的近12 倍，且人工接种鉴定结果与分子标记结果一致的比例达到92.73%，即153 个样本含有分子标记，同时也确实表现出抗病性，符合本试验的设想，即可以通过分子标记筛选抗PVY 的材料。

产量评价中，9 个杂交组合后代的平均单株结薯数偏少，为3.28～5.26 个，平均单株产量偏低，为0.27～0.35 kg，且不同年份间产量变化比较大，平均变异系数分别为0.57 和0.68。究其原因主要为美国资源材料偏早熟且晚疫病抗性比较差，而云南大春生产季晚疫病高发，尽管田间管理时对晚疫病严格防控，但是部分株系仍在未达到最佳产量前死亡而导致减产或绝收。本试验从372 个株系中筛选出10 份产量较高、抗性较好的资源材料，可为抗PVY 和薯条加工型马铃薯新品种选育提供优良的亲本材料。