酸橙内生菌Bacillus thuringiensisBt028 几丁质酶的分离纯化及其酶学性质

徐勤茜，朱国威，赵梓伶，陶雪婷，李子院,2，郝再彬,2，李海云,2,

（1.桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004；2.广西高校食品安全与检测重点实验室，广西桂林 541004）

几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺组成的直链多聚物[1−3]，在自然界中含量仅次于纤维素[4−5]。由于几丁质与天然物机体细胞有良好的生物兼容性[6−8]，因此广泛应用在食品、医药、生物工程、农业等方面[9−11]，但由于自然状态下几丁质多以晶体状态存在，不溶于水且不易降解，这极大地限制了几丁质的应用。目前降解几丁质的方法主要有化学法、物理法和酶解法[12]。然而化学法反应条件比较严苛，且反应产物不均一，对环境污染严重；物理法由于生产成本比较高，不适用于工业化生产；酶解法与物理法和化学法相比，有降解反应专一性强，不产生环境污染，可控制聚合度而且副反应少等优点，是目前最环保高效的降解几丁质方法[13−15]。几丁质酶（EC3.2.1.14）可以特异性催化几丁质降解，得到N-乙酰氨基葡萄糖和聚合度为2~10 的几丁寡糖，研究表明这些产物对人体的生态调节功能具有较好的改善提高作用[16−18]。

近年来，几丁质酶由于在制备几丁寡糖、食品保鲜等方面具有巨大的应用潜力而备受关注[19]。微生物来源的几丁质酶由于生产速度快、产量高且性能稳定，目前已成为几丁质酶的主要来源[20−21]。几丁质酶的酶学特性是其应用的基础，国内外研究者对微生物来源几丁质酶的酶学特性进行了大量研究，如Du 等[22]从一株分离自土壤样品的细菌Paenibacillussp 发酵液中纯化得到一种分子量为30 kDa 的几丁质酶，其最佳pH 为4.5，最佳温度为50 ℃；Guo 等[23]对Paenibacillus pasadenensisCS0611 胞外几丁质酶进行纯化，测定几丁质酶分子量为69 kDa，最适pH 和最适温度分别为5.0 和50 ℃；苏明慧等[24]从安徽西瓜种植地根际土壤分离所到一株短短芽孢杆菌FM4B，对其发酵液中的几丁质酶进行分离纯化，获得分子质量为66 kDa 几丁质酶纯品，且酶活力在pH5.0~9.0 稳定；刘蒲临等[25]将土壤中分离出的侧孢短芽孢杆菌CDY64 几丁质酶基因表达于大肠杆菌BL21 中，纯化后的几丁质酶最适反应温度为60 ℃，在pH6.0~8.0 范围内均表现出良好的活性。可见，不同微生物来源的几丁质酶的性质可能不同。目前尚未见有酸橙内生菌产几丁质酶的酶学性质研究。

本研究以前期筛选获得的一株产几丁质酶活性较高的酸橙内生菌Bacillus thuringiensisBt028 为研究对象，对其发酵液中的几丁质酶进行分离纯化，并对该几丁质酶的酶学性质进行研究，为该酶的应用奠定基础，同时也为不同生物来源的几丁质酶系的性质和功能的比较研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸橙 采自桂林永福苏桥镇，新鲜酸橙果实；酸橙内生菌Bacillus thuringiensisBt028 分离自酸橙果实，保存于桂林理工大学生物工程实验室；几丁质、3，5-二硝基水杨酸、β-D-N-乙酰氨基葡萄糖 分析纯，购于上海易恩化学技术有限公司；硫酸镁、硫酸亚铁 分析纯，购于天津市大茂化学试剂厂；蛋白胨、酵母粉、琼脂磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、Tris 分析纯，购于西陇化工股份有限公司；低分子量蛋白质Marker PR1400、葡聚糖凝胶G-100 北京索莱宝科技有限公司；活化培养基 蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂15 g/L；几丁质酶发酵培养基 胶体几丁质10 g/L、酵母粉10 g/L、K2HPO40.7 g/L、KH2PO40.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7 H2O 0.01 g/L，pH7.0。

LRH-150-Z 振荡培养箱 珠江留关市泰宏医疗器械有限公司；BX30R 立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司；CJ-ISFS 医疗设备超工作台 天津市泰斯特仪器有限公司；VIS-7220N 可见分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司；HH-S2 数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；ZXRD-B5110 鼓风干燥箱 上海智城分析仪器制造有限公司；Bio-Rad电泳仪、小型垂直电泳槽 上海孚约商贸有限公司；BSZ-160 自动部分收集器、HL-2B 恒流泵 上海青浦沪西仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 几丁质酶的分离纯化

1.2.1.1 几丁质酶粗酶液的制备 参考文献[24]的方法并加以改进，将斜面保存的Bacillus thuringiensisBt028 经平板培养活化24 h 后，挑取一环接入100 mL几丁质酶发酵培养基中（250 mL 三角瓶），在温度为30 ℃，转速为180 r/min 的摇床上振荡培养24 h，即为种子液。将种子液按照3%的接种量接入到装有100 mL pH7.0 的几丁质酶发酵培养基的250 mL 三角瓶中，在温度为30 ℃、转速为180 r/min 的摇床上振荡培养48 h。发酵液在4 ℃、12000 r/min 条件下离心10 min，收集上清液即为粗酶液，4 ℃冰箱储存。

1.2.1.2 硫酸铵盐析 参考刘美艳等[26]的方法并略作修改：分别取10 mL 粗酶液8 份置于烧杯中，加入固体（NH4）2SO4调节使各烧杯中酶液的（NH4）2SO4饱和度分别为0%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4 ℃下静置过夜后，10000 r/min 离心，测定上清液中总蛋白含量及几丁质酶活力，并绘制（NH4）2SO4盐析曲线。根据（NH4）2SO4盐析曲线确定菌株Bt028 几丁质酶的分级沉淀条件后，对菌株Bt028 发酵液进行（NH4）2SO4盐析。盐析后的沉淀加入适量50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）缓冲液溶解后装入透析袋内，4 ℃下用50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）缓冲液透析除盐。

1.2.1.3 葡聚糖凝胶Sephadex G-100 层析 在室温下，将葡聚糖凝胶干粉浸泡于蒸馏水中充分溶胀后装柱（1 cm×70 cm），并用50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5，含有0.2 mol/L NaCl）缓冲液平衡后，取1.0 mL 经透析除盐的酶液，上样于层析柱，用相同的缓冲液洗脱，流速为8 mL/h，分管收集洗脱液，每管收集3.5 mL，检测并收集有酶活性的洗脱峰。

1.2.1.4 几丁质酶纯度和分子量测定 参考陈茜文等[11]方法用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯化前后几丁质酶纯度及相对分子质量。

1.2.2 菌株Bt028 几丁质酶的酶学性质

1.2.2.1 最适反应温度及热稳定性 分别选取30、40、50、60、70、80 ℃作为酶催化反应温度，测其酶活，以确定菌株Bt028 几丁质酶的最适反应温度。将菌株Bt028 几丁质酶酶液置于35、40、45、50、55、60、65、70 ℃水浴中保温不同时间后，取样测定酶液的剩余酶活力，考察酶的热稳定性。

1.2.2.2 最适pH 及pH 稳定性 在最适反应温度条件下测定几丁质酶pH 为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 时酶活力，确定菌株Bt028 几丁质酶的最适反应pH。将几丁质酶液pH 调为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在30 ℃下放置0、1、2、3、4、5、6 h，测定酶液的剩余酶活力，考察pH 对菌株Bt028 几丁质酶稳定性的影响。

1.2.2.3 金属离子的影响 在30 ℃条件下，向底物胶体几丁质溶液中分别加入1 mmol/mL 不同的金属离子如Mg2+（MgSO4·7H2O）、Fe3+（FeCl3·6H2O）、Cu2+（CuSO4·5H2O）等，与酶液混合后反应测定几丁质酶酶活力，以不加金属离子为对照，考察不同金属离子对几丁质酶酶活力的影响。

1.2.2.4 有机溶剂对几丁质酶活的影响 选择甲醇、乙醇、正丙醇、甲醛、丙酮、二甲亚砜为效应物，在底物胶体几丁质溶液中加入0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%的效应物，调pH 为6.5，在60 ℃条件下测定酶的相对活力，分析研究效应物对Bt028 几丁质酶活力的影响。

1.2.2.5 酶催化反应动力学常数测定 分别取含0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%胶体几丁质的磷酸缓冲液与pH 为6.5 几丁质酶液在60 ℃条件下反应，根据底物浓度对酶催化反应速率的影响，采用Lineweaver-Burk 双倒数法构建动力学模型，计算菌株Bt028 几丁质酶催化胶体几丁质水解的米氏常数Km、最大速度Vmax 以及转换数Kcat。

1.2.3 几丁质酶酶活的测定 参考戴德慧等方法[27]略作修改：取0.5 mL 粗酶液与0.5 mL 含1.0%胶体几丁质的磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH7.0）混合，50 ℃保温20 min 后，沸水浴10 min，流水冷却。加入1.0 mL DNS 试剂，沸水浴5 min，流水冷却后用蒸馏水稀释至10 mL，12000 r/min 离心5 min，取上清液测定波长540 nm 处吸光度（以不含胶体几丁质的磷酸缓冲液为参照）。根据A540nm在β-D-N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线上查得还原糖的释放量并计算酶活力。以每分钟催化几丁质生成相当于l μmolβ-D-N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。相对酶活（%）=（实验组酶活/空白组酶活）×100。

1.2.4 蛋白质含量的测定 参考聂昌宏[28]方法，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。相对蛋白质含量（%）=（实验组蛋白质含量/空白组蛋白质含量）×100。

1.3 数据处理

实验中每个处理重复三次，采用SPSS 软件分析数据的显著性，利用Origin 以及Excel 对实验数据处理分析并进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 几丁质酶的分离纯化

2.1.1 硫酸铵盐析 苏云金芽孢杆菌Bt028 发酵液经过离心后，取上清液进行（NH4）2SO4分级盐析，盐析后的上清液中蛋白质浓度和几丁质酶活随（NH4）2SO4饱和度的变化情况如图1 所示。由图1可见，上清液中的几丁质酶活力和总蛋白含量均随（NH4）2SO4饱和度的增加而降低；当（NH4）2SO4饱和度低于20%时，总蛋白含量下降的趋势快于几丁质酶活力下降趋势，表明杂蛋白盐析的速度比几丁质酶快；当（NH4）2SO4饱和度大于20%后，上清液中酶活迅速降低，说明此时几丁质酶不断被沉淀出来；当（NH4）2SO4饱和度达到70%时，上清液中几乎检测不到几丁质酶活，说明（NH4）2SO4饱和度达到70%时几丁质酶已基本沉淀完全。据上综合考虑，确定硫酸铵盐析方案为：20%饱和度的（NH4）2SO4盐析除杂、70%饱和度的（NH4）2SO4沉淀几丁质酶。当盐浓度增高到一定数值时，会导致水活度降低，进而使蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，使蛋白质相互结合聚集形成沉淀析出[29]。本研究所确定的沉淀区间获得的酶回收率为61.24%，比郭金玲等[30]以35%~80%硫酸铵饱和区段对黑曲霉Aspergillus niger粗酶液进行沉淀，酶的回收率为47.26%更高。

图1 硫酸铵盐析曲线Fig.1 Salting out curve of ammonium sulfate

2.1.2 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶层析 经硫酸铵沉淀后的酶液采用Sephadex G-100 凝胶层析，洗脱曲线见图2。

图2 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶层析洗脱曲线Fig.2 Elution curve of Sephadex G-100 Dextran gel chromatography

图2 显示，样品通过凝胶层析，共获得4 个蛋白峰，其中峰I 具有最高的几丁质酶活力，收集该峰浓缩浓缩后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2.1.3 几丁质酶纯化结果分析和纯度鉴定 Bt028所产几丁质酶的纯化结果总结于表1。从表1 可以看出，苏云金芽孢杆菌Bt028 发酵液中几丁质酶经硫酸铵盐析和葡聚糖G-100 凝胶层析后，所获几丁质酶的比活力达681.78 U/mg，纯化倍数3.21 倍，酶回收率为15.52%。目前已有诸多关于不同来源几丁质酶的分离纯化报道，如高兆建等[31]通过硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose A52 离子交换层析和Sephadex G-100 凝胶过滤层析纯化得到均一的Chi-Pc76，最终纯化倍数为17.1 倍，回收率21.6%；Farag 等[32]对海洋来源土曲霉培养液中的几丁质酶通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-100 凝胶过滤层析以及离子交换色谱进行分离纯化，纯化倍数5.16，回收率为12%。本文通过硫酸铵盐析及Sephadex G-100 凝胶层析即可获得纯度较高的几丁质酶，说明本文所采用的Bt028菌株产生的杂蛋白较少，在几丁质酶合成中具有较好的应用潜力。

表1 苏云金芽孢杆菌Bt028 几丁质酶的纯化结果Table 1 Purification results of chitinase produced byBacillusthuringiensisBt028

几丁质酶纯化样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳谱图见图3。由条带3 可以看出纯化后得到单一蛋白条带，其相对分子质量约为65 kDa。不同微生物来源的几丁质酶的分子量差异较大，一般在10~110 kDa之间，如大部分细菌所产几丁质酶的分子量在60~110 kDa 之间，放线菌的一般不高于30 kDa，而真菌所产几丁质酶的则高于30 kDa[33]。不同来源的苏云金芽孢杆菌几丁质酶相对分子量之间也存在较大差异，如刘佳等[34]从Bt HD-73 菌株中克隆、重组的几丁质酶Chi73 分子量为77 kDa。

图3 菌株Bt028 产几丁质酶的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE of chitinase fromBacillus thuringiensisBt028注：Marker：标准蛋白；1：粗酶液；2：20%~70%硫酸铵盐析酶液；3：葡聚糖凝胶G100 层析酶液。

2.2 几丁质酶的酶学性质

2.2.1 几丁质酶的最适反应温度和热稳定性 在不同温度下测定菌株Bt028 几丁质酶的酶活，结果如图4 所示。结果表明：在60 ℃时酶活显著提高（P＜0.05），故该几丁质酶的最适反应温度为60 ℃，比丁志雯等[35]从Dyadobactersp. CZW019 中得到的几丁质酶反应最佳温度（35 ℃）高。几丁质酶的热稳定性结果如图5 所示，在温度低于60 ℃范围内酶的热稳定性良好，超过60 ℃后随着保温时间的增加，酶活力迅速下降，热稳定性变差。

图4 几丁质酶的最适反应温度Fig.4 Optimum reaction temperature of chitinase注：不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）；图6、图8 同。

图5 几丁质酶的热稳定性Fig.5 Thermal stability of chitinase

2.2.2 几丁质酶的最适反应pH 和pH 稳定性 pH能显著影响酶反应速率，由图6 可以看出，当pH 为6.5 时酶活显著提高（P＜0.05），说明苏云金芽孢杆菌Bt028 最适反应pH 为6.5。当pH 高于或者低于6.5时，酶活迅速降低。pH 对酶活性的影响并不是因为作用于整个酶分子，从而影响酶分子的解离状态，而是由于酶的活性中心或与之有关的基团的解离状态被改变，从而使酶的活性状态发生改变，因此过酸和过碱都会大大降低酶的活性。菌株Bt028 几丁质酶的最适pH 与来源于其它芽孢杆菌的几丁质酶最适pH 高，如来源于短短芽孢杆菌的几丁质酶最适pH为6.0[24]，但明显比苏云金芽孢杆菌来源的几丁质酶的最适pH 为7.0 低[34]，说明两者性质存在差别，并不是同一种几丁质酶。几丁质酶的pH 稳定性结果如图7 所示，在pH 5.5~7.5 范围内，该几丁质酶稳定性较好，当pH 低于5.5 或高于7.5 后，随着时间的延长，相对酶活逐渐降低；当pH 为6.5 时其稳定性最好，处理6 h 后相对酶活力仍在90%以上。

图6 几丁质酶的最适反应pH Fig.6 Optimum reaction pH of chitinase

图7 几丁质酶的pH 稳定性Fig.7 pH stability of chitinase

2.2.3 金属离子对几丁质酶活性的影响 从图8 可以看出，与空白相比，Co2+、Mg2+、Ca2+、Hg2+这四种金属离子对几丁质酶有一定程度的抑制作用，但酶仍具有一定的活性，其中Mg2+的抑制作用最为明显；Fe3+和Cu2+使酶活力显著提升（P＜0.05）。金属离子能够与酶形成络合物，从而维持或破坏其三维结构和构型，在生物催化中起重要作用[31]。张瑶心等[36]对无色杆菌ZWW8 产几丁质酶的酶学性质进行研究，发现Cu2+和Zn2+对酶活有抑制作用，Hg2+可导致几丁质酶完全失活，说明不同来源几丁质酶性质不一定相同。

图8 金属离子对几丁质酶活的影响Fig.8 Effect of metal ions on chitinase activity

2.2.4 有机溶剂对几丁质酶活的影响 不同有机溶剂对几丁质酶活的影响如图9 所示，甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亚砜对几丁质酶的作用效果为先激活后抑制，当甲醇、乙醇和正丙醇的浓度为5.0%，二甲亚砜浓度为2.5%时，酶活力达到最高，随着这几种有机物含量的继续提高，酶活力下降。当正丙醇浓度为25.0%时，可以使酶活力降低23.9%。故正丙醇对酶的失活作用比甲醇和乙醇强。而丙酮浓度越高，对几丁质酶活力的激活作用越强，在丙酮浓度为0%~10.0%之间，酶活力持续上升，当浓度超过10.0%，酶活力趋于稳定25.0%。随着甲醛浓度的增大，酶的活力呈直线下降，25.0%的甲醛抑制酶活力58.2%。

图9 有机溶剂对几丁质酶活力的影响Fig.9 Effect of different organic solvents on the activity of chitinase

2.2.5 几丁质酶反应动力学常数测定 菌株Bt028几丁质酶催化胶体几丁质水解反应的Lineweaver-Burk 双倒数图如图10 所示，得到的直线回归方程为：y=0.271x+0.009（R2=0.99807），根据该直线在x 轴和y 轴上的截距计算出在pH 为6.5、60 ℃的酶活测定体系中，菌株Bt028 几丁质酶对胶体几丁质的米氏常数Km 为29.533 mg/mL，最大反应速率Vmax=108.696 μmol/（L·min），酶的转换数Kcat=0.527/min。

图10 几丁质酶催化动力学Lineweaver-Burk 双倒数图Fig.10 Lineweaver-Burk double reciprocal diagram of chitinase catalytic kinetics

3 结论

当前主要通过微生物发酵来生产酶制剂，这种方式生产周期短、且不易受外部因素的影响，但由于粗酶活力不高，导致大批工业用酶制剂的规模化应用受到限制。因此，通过对粗酶液纯化可以提升酶制剂产品质量。本文对苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensisBt028 所产几丁质粗酶液采用20%~70%硫酸铵分段盐析，纯化倍数为1.16，回收率为61.24%；经Sephadex G-150 葡聚糖凝胶柱层析后，得到了4 个洗脱峰，其中组分峰Ⅰ具有最高的几丁质酶酶活力，比活力可达681.78 U/mg，纯化倍数达3.21 倍。通过SDS-PAGE 电泳测定纯品酶分子质量为65 kDa，与Azizoglu 等[37]已报道纯化的苏云金芽孢杆菌几丁质酶产生的条带分别为39.71、41.39、91.66 和110~113 kDa 相比较差异较大。此外，本文对Bacillus thuringiensisBt028 所产几丁质酶的酶学性质也进行了分析，结果显示该酶最适反应温度为60 ℃，在65 ℃以下保温6 h 后酶活力剩余84.37%，在70 ℃保温6 h 是酶活力剩余67.40%，表明该酶的热稳定性较好。该几丁质酶的最适pH 为6.5，Co2+、Mg2+、Ca2+、Hg2+等金属离子对几丁质酶有一定程度的抑制作用，Fe3+和Cu2+对酶有促进作用。低浓度的甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亚砜使酶的活性增加，当有机溶剂浓度提升到一定程度时，酶的活性受到抑制，与邱君志[38]对几丁质酶的研究结果相似。丙酮对几丁质酶有激活作用，而甲醛对几丁质酶有抑制作用。通过酶动力学分析可知，以胶体几丁质为底物时，该酶催化反应的米氏常数Km 为29.533 mg/mL，最大反应速率Vmax=108.696 μmoL/（L·min），酶的转换数Kcat = 0.527/min。稳定性实验研究表明几丁质酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性。由此可见对粗酶液进行纯化可大幅提高几丁质酶稳定性，这对于提高工业生产中几丁质酶的作用效率具有非常积极的意义，本研究采用的均为传统的纯化方法，但纯化后总酶活损失较大，这不利于提高几丁质酶制剂生产的经济效益，因此后续研究中有必要改进纯化方法，以提升酶的回收率。