冻干预处理对烤后废弃烟叶产甲烷潜力的影响

徐建雪，薛寒光，黄弘毅，何岳巍，韩睿，彭星，黎娟*

（1.湖南农业大学农学院，长沙 410128；2.湖南碧臣环境能源有限公司，长沙 410100；3.青海大学农林科学院，青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，西宁 810016；4.湖南联合餐厨垃圾处理有限公司，长沙 410022）

烤后废弃烟叶是指烟草行业中烘烤后不能使用的低等级或等级外烟叶，以及卷烟企业积存的霉变烟叶、烟末、烟梗等。烟叶在烘烤过程中，经特定的温度和湿度调节不断脱水干燥，外观质量及内部化学成分都会发生变化，因此烤后废弃烟叶具有以下特点：（1）烟叶叶色发黄，叶片收缩干燥，出现沟壑；（2）有机质含量丰富。鲜烟叶内淀粉、蛋白质等大分子物质在烘烤过程中转化为小分子的糖及氨基酸，烤后烟叶总糖含量为15%～35%，果糖与葡萄糖含量分别为烘烤前的5.51 倍和8.31 倍。烟草废弃物属于非卖品，需要规避流入市场造成假烟泛滥，目前对于烤后废弃烟叶的处理方法主要有焚烧、水浸、毁形及填埋等，这些处理方法不仅会造成烤后废弃烟叶资源的巨大浪费，而且会产生浓烟、污水等环境污染物。

厌氧生物降解技术具有可回收生物质能源、提供优质沼肥、杀灭病原菌等优点，甲烷作为其主要生物质能源，可实现与其他能源载体的灵活转换，是可再生能源规模化发展的必要支撑。据统计，我国年产烟叶约480 万t，在烟叶加工过程中会产生20%～25%的烟叶废弃物，环境污染问题突出。利用烤后废弃烟叶进行厌氧发酵，能产生甲烷等清洁能源，沼渣、沼液制成有机肥还能用于改良烟田土壤。目前学术界和工业界大量厌氧消化的应用研究都是以粮食作物秸秆和养殖等农业废弃物为研究对象，而对烟草等经济作物废弃物的资源化利用研究较少。黄弘毅等利用烤后废弃烟叶进行甲烷潜力测试，发现烤后废弃烟叶产甲烷潜力为252.7 mL·g（以挥发性固体计），是良好的生物质原料。然而，烤后废弃烟叶属纤维素类原料，内部紧密相连的木质素、纤维素与半纤维素阻碍了微生物和酶对物料的降解。合理的预处理可以破坏木质纤维素结构、增大接触面积、提高产气效率。纤维素类物料的预处理方法主要有物理法、化学法、生物法以及物理化学法。化学预处理需投入较高成本的化学试剂，操作复杂，易产生抑制物。生物预处理周期较长，生物酶及菌剂的成本高，难以大规模投入生产。物理化学预处理强度一般较高，物料有机成分易损失或变性转化，且伴随有抑制物生成等问题。物理预处理可降低生物质的粒度或结晶度，破坏半纤维素和木质素的结合层，增大物料的比表面积，提高纤维素的酶解转化率。AL AFIF 等通过简单的物理预处理技术减小棉花秆粒径不仅能增加甲烷产量，还能有效缩短棉花秆发酵周期。因此，找到一种既能保持烤后废弃烟叶有机成分又能有效提高产甲烷效率的预处理方法尤为重要。

冷冻真空干燥（冻干）技术克服了传统预处理高温、高强度运行条件导致的有机化学成分流失、转化等问题，该技术利用水的三相原理，可在高真空、低温状态下，达到物料水分冰晶升华干燥的目的。冻干技术不仅能有效保持物料营养成分，还能在升华过程中留下冰晶孔隙，保持物质外观形态。目前，冻干技术已广泛应用于制药与食品行业，冻干处理除了能够较好地保持蛋白质、脂肪及总酚等营养物质，增加还原糖含量，还能保持疏松多孔的组织结构。低温条件下热敏物质不易变形，挥发性有机物质不易挥发，从而有利于充分保持物料有机质含量及原有特性。冻干预处理除了能保持物料特性与原有结构，还能对物料中纤维素降解产生一定的影响。ROONI等通过对小麦秸秆进行冷冻预处理得到结论：冷冻预处理对小麦秸秆纤维素含量无明显影响，但能显著增加纤维素的降解能力。QI等的研究表明，花生壳经过冷冻预处理后，细胞发生分层与剥离，从而提高了生物质回收效率。尽管我国真空冷冻干燥装备产业齐全，在食品和中医药加工领域冻干技术也有广泛的应用，但鲜有利用冻干预处理技术辅助农业废弃物转化为高效、清洁生物质能源的相关研究。

本研究旨在利用冻干技术既能保持物料物理形态结构，又能最大程度保持发酵物料营养成分的特点，通过对烤后废弃烟叶进行不同时长的冻干预处理，进行各表征参数分析，探索冻干预处理对烤后废弃烟叶产甲烷潜力（BMP）的影响，以期为冻干预处理技术应用于厌氧发酵产甲烷及废弃烟叶资源化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用烤后废弃烟叶为湖南省郴州市桂阳县白云村当季烘烤不合格烟叶，手动将烤后废弃烟叶裁剪为约1 cm×1 cm 方形薄片后混合均匀，平均分成6 等份，置于4 ℃冰箱中储存备用。

实验用接种物取自中国山东民和牧业大型沼气发电一期工程中以鸡粪与废水为原料的厌氧污泥，样品置于4 ℃冰箱中储存备用。实验开始前一周将接种泥在中温（37 ℃）厌氧条件下进行驯化，以消耗接种物中的残留有机物，减小实验误差。预培养结束后，对接种物pH、总固体含量（Total solid，TS）、挥发性固体含量（Volatile solid，VS）进行测定，结果显示接种物pH为7.34，TS为2.46%，VS为1.33%。

1.2 实验方法

1.2.1 冷冻干燥预处理

本实验采用冻干机（SCIENTZ-18N，宁波新芝生物科技股份有限公司）进行样品冷冻真空干燥预处理，设备主要由制冷系统、真空系统、加热系统以及电器仪表控制系统组成，实验过程示意图见图1。将裁剪好的6份烤后废弃烟叶中的5份放入-20 ℃冰箱中冷冻24 h，冷冻结束后其中1 份直接常温解冻备用（L1），其余4 份样品分别在最低压强20 Pa、最低温度-50 ℃的冻干机中进行不同时长（1、3、5、10 h）的冻干预处理，编号分别为L2、L3、L4、L5（表1）。

表1 预处理条件及烟叶含水率Table 1 Pretreatment settings and moisture content of cured tobacco leaves

1.2.2 物料产甲烷潜力测试

采用全自动甲烷潜力测试仪（MultiTalent-203，Nova Skantek 碧臣仪器）对烤后烟叶进行BMP 测试。全自动甲烷潜力测试仪由A 单元（发酵单元）、B 单元（CO等酸性气体吸附单元）、C单元（气体计量及数据处理采集单元）3 个单元构成，见图1。A 单元由恒温水浴锅、发酵瓶和机械搅拌系统组成，恒温水浴锅保证发酵温度，机械搅拌防止物料结壳、酸化；B 单元配备100 mL 玻璃瓶，其中的3 mol·L氢氧化钠溶液用以吸附沼气中的CO及HS 等酸性气体；C 单元为甲烷气体计量装置，内置脉冲信号数据自动采集系统及温度、压力传感器，最终记录结果为标准状况下（0 ℃、101.3 kPa）的甲烷累积体积。

图1 实验过程示意图Figure 1 Schematic representation of the experimental processes

参考德国VDI 4630标准进行BMP 测试，相关测试的主要参数见表2。500 mL 批式玻璃发酵瓶内添加接种泥和烤后废弃烟叶混合物400 g，在37 ℃水浴锅中进行厌氧发酵，接种泥VS 质量与烤后废弃烟叶VS 质量为2∶1。设置纯接种泥厌氧发酵为空白对照，以消除接种物内源性甲烷产量对物料BMP 的影响；设置标准纤维素（Sigma-C6288）作为对照试验物料，用于检测接种物活性；每个处理进行3 次重复。设备安装完毕后，检查设备气密性，设置发酵瓶搅拌时间为5 min，搅拌速率为40 r·min，间隔时间为1 500 s。当连续3 d 甲烷单日产量小于总产气量1%时结束实验。

表2 BMP测试条件设置Table 2 Conditions used to BMP test

1.3 分析方法

物料及接种物的TS、VS 采用质量法测定，在105 ℃烘箱中烘干至质量恒定后测定TS，在马弗炉中550 ℃灼烧至质量恒定后称质量计算VS。扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）结果由扫描电子显微镜（日立TM3030）扫描烤后废弃烟叶表面得到。傅里叶红外光谱（FTIR）分析采用固体溴化钾压片法，取400～4 000 cm波长进行色谱分析。烟碱含量采用紫外分光光度法测定，准确称取1 g 干燥烤后废弃烟叶粉末于250 mL 锥形瓶，加入蒸馏水、沸石与饱和HCl 振荡摇匀，过滤定容至250 mL 锥形瓶，用紫外分光光度仪测定样品溶液烟碱含量。总糖含量采用流动分析法测定，精确称取0.5 g干燥烤后废弃烟叶粉末于锥形瓶，加入3%醋酸水溶液100 mL，振荡摇匀30 min，过滤后得醋酸样液，然后采用流动分析仪进行检测。对每个处理均进行3 组重复样品测定，测定结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1 烤后废弃烟叶表面微观结构变化

SEM 是观察物料物理结构变化的有效方法之一。为深入探究冻干预处理对烤后烟叶微观表面结构变化与BMP 的关系，对预处理前后烤后废弃烟叶进行SEM 分析，结果如图2 所示。由SEM 图可知，未经预处理的烤后废弃烟叶L0 表面结构纹理饱满整齐；经预处理后的烤后废弃烟叶表面变得皱缩粗糙，且伴随有颗粒状的析出物。这表明在冷冻过程中烤后废弃烟叶结构受损、细胞膜碎片化，导致细胞损伤和失水，出现组织收缩和细胞塌陷变形，这与SEMENOV 等的研究结果一致。在冻干技术的真空升华过程中，烤后废弃烟叶内部多余水分直接升华，水分冰晶化时表面呈现褶皱和卷曲，但孔洞和裂隙结构被保留下来，从而产生疏松多孔的物理结构。冻干预处理与冷冻预处理相比，表面析出物更少，且随着冻干时间的增加，表面颗粒状物质越来越少。在冷冻过程中，由于细胞失水，烟叶细胞组织出现不同程度的损伤，营养物质随水分析出至表面；在升华及解析干燥过程中，温度升高及压差作用造成挥发性有机物质部分损失，所以干燥时间越长，烤后废弃烟叶表面颗粒物越少。

图2 烤后烟叶扫描电镜图（×500倍）Figure 2 Scanning electron microscope of cured tobacco leaves（×500 times）

2.2 烤后废弃烟叶木质纤维素结构变化

图3 烟叶傅里叶红外光谱图Figure 3 FTIR spectra of raw and steam explosion pre-treated cured tobacco leaves

2.3 烤后废弃烟叶总糖及烟碱含量

烟叶经烘烤后，淀粉含量减少，糖类物质增加，在烘烤过程中，占烟叶干物质质量约25%的淀粉转化为糖，烤后烟叶总糖含量为25%～35%，是良好的厌氧生物发酵原料。由图4 可知，与未处理烟叶L0 相比，冷冻与冻干烤后废弃烟叶总糖含量降低，且随着冻干时间的延长，总糖含量逐渐降低。L0 总糖含量最高，为19.78%，分别高出L1、L2、L3、L4 及L5 处理0.33、0.66、0.57、1.09、1.04 个百分点。HARGUINDEGUY 等的研究表明，在冷冻过程中葡萄糖、蔗糖及麦芽糖等碳水化合物会随水分析出，从而造成部分营养成分流失。张康逸等采用冻干处理技术对谷物营养品质进行研究发现，长时间冻干会导致谷物营养成分损失。在本研究中的解析干燥阶段，由于内外压差与浓度差较大，物质发生扩散，疏松多孔的良好蜂窝状结构使烤后废弃烟叶中的糖类物质更容易逸出。

图4 烟叶烟碱及总糖含量Figure 4 Nicotine and total sugar content of cured tobacco leaves

烟碱是烟草中特有的次生代谢产物，在烟草多种生物碱中烟碱所占比例最高，超过90%，占烟草植株干质量的0.6%～3.0%。由图4 可知，L0 烟碱含量最高为1.93%，其次为L4、L5、L1、L3，L2 烟碱含量最低，为1.75%，随着冻干时间的延长，L3、L4、L5 处理的烟碱含量略有升高。烟碱在60 ℃时能与水反应生成相应的水合物，但是低温环境下烟碱不易溶于水，且冻干预处理烟叶在干燥过程中糖类等有机物质损失，烟碱相对含量增加，所以经过长时间冷冻干燥预处理后烟碱含量略有增加。

2.4 不同处理烟叶的BMP

BMP指标准状况下单位质量VS在厌氧条件下的产甲烷量（mL·g）。BMP 测试可以评估厌氧条件下有机物料的生物可降解性及产甲烷潜力，还可以监测发酵过程中的微生物抑制及毒性作用等，是评判物料厌氧发酵可行性的一大重要指标。

经23 d厌氧发酵后，不同处理烤后废弃烟叶每日甲烷产量及单位VS累积甲烷产量如图5和图6所示。由图5 可知，所有处理均在第3 天时达到甲烷产气高峰，且L3 产气速率（83.51 mL·d）最快，较其他处理高13.89%～25.33%。包括L0 在内的所有处理每日产甲烷速率均呈现相同趋势，即前期快速增长，发酵第3 d达到产气高峰后缓慢下降。造成烤后废弃烟叶产气前期快后期缓慢的原因是：发酵前期，水解酸化菌在短暂的适应期后快速繁殖，将纤维素、半纤维素等易分解有机物分解转化为产甲烷菌可直接利用的乙酸等有机物。易降解有机物水解酸化结束后，相对难降解的有机物才逐步被分解，所以此时产气速率缓慢下降，并逐渐趋零。

图5 烟叶每日甲烷产量Figure 5 Daily methane yields of cured tobacco leaves

图6 烟叶累积甲烷产量Figure 6 Cumulative methane yields of cured tobacco leaves

由图6可知烤后废弃烟叶经23 d厌氧发酵后，L0处理的BMP（200.74 mL·g）最低，L3 处理的BMP（224.28 mL·g）最高，其次为L2、L4、L5 和L1。与L0相比，其他处理烤后废弃烟叶BMP 显著增加（＜0.05），其中L2及L3处理的BMP 与L0呈极显著差异，L1、L4 及L5 处理呈现显著差异。与L0 相比，L1 处理BMP 增加3.94%，L3 处理BMP 增加11.73%，其他冻干预处理BMP 增加4.26%～10.08%，L2、L4 与L5 处理BMP 分别为220.98、211.11 mL·g和209.30 mL·g。冻干预处理烤后废弃烟叶水分从冰晶状直接升华，所占空间仍然保留，物料疏松多孔，收缩较小，疏松多孔的蜂窝结构有利于微生物与物料接触，有利于烟叶降解，所以冻干预处理烤后废弃烟叶累积甲烷产量大于冷冻预处理。然而，冻干时间超过3 h后，随冻干预处理时间增加烤后废弃烟叶累积甲烷产量逐渐降低。造成BMP 随冻干时间延长而下降的原因主要有3 个方面：第一方面为烤后废弃烟叶有机物损失。延长冻干时间后，由于较大的内外压差与浓度差，物质发生扩散，烤后废弃烟叶糖类物质及挥发性有机物逸出；第二方面是烤后废弃烟叶热敏物质变性。烤后废弃烟叶经过烘烤后含水量较低，所需干燥时间比含水量丰富的新鲜菠菜（干燥时间5～6 h）、新鲜香椿（干燥时间5 h）等叶片类物料短，约在3 h 时烤后废弃烟叶已完成干燥，进行解析干燥的温度逐渐升高会造成蛋白质等热敏物质变性，使烤后废弃烟叶营养品质下降，影响产气效率；第三方面为烟碱抑制作用。由于长时间的解析干燥，烤后废弃烟叶中的糖类等有机质损失，烟碱相对含量增加，而LIU 等研究表明烟碱对厌氧微生物种群活性有一定程度的抑制作用，与本文结果一致，所以烟碱含量越高，甲烷产量越低。

3 结论

（1）冻干预处理不仅能很好地保持烤后废弃烟叶的营养品质，还能有效增大微生物接触面积，增加甲烷产量。与未处理烟叶相比，预处理烤后废弃烟叶整个发酵周期无抑制和滞后现象，产甲烷潜力提高了3.94%～11.73%。

（2）冻干预处理具有低温、高真空的特点，因此能耗较高，且随着冻干预处理时间的延长，在相对内外压差与浓度差较大的环境中，物质发生扩散，容易造成有机物质损失。在烤后废弃烟叶冻干预处理的后续研究中，应定量分析预处理过程中有机物损失情况；并平衡好甲烷产量提升与预处理能耗的关系，控制预处理时间，优化冻干工艺。

（3）冷冻预处理能解除烤后废弃烟叶水解限速，对甲烷产量有一定的提升作用。对于寒温带及中温带等冬季温度较低的地区，可结合自然气候条件对纤维类农业废弃物进行室外冷冻存储，优化沼气工程原料供应及运输调配，提升酸化水解效率，促进农业废弃物资源化高效利用。