*王倩楠 石锦峰 郑家勤 王晗毓 董自波,2*
(1.江苏海洋大学药学院 江苏 222005 2.海洋药用资源开发工程研究中心 江苏 222005)
蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)属多年生草本植物,广泛分布于我国西南和西北等地区,是一种药食同源的中药材资源[1]。现代研究表明,蒲公英富含有机酸、黄酮、多糖、甾醇、三萜等有效成分[2-3]。蒲公英有机酸包括绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、单咖啡酰酒石酸、阿魏酸等,具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用[4]。此外,菊苣酸还能降脂、降糖、提高人体免疫力[5]。蒲公英临床可用于胃溃疡和上呼吸道感染等疾病治疗[6]。作为产量大、价廉易得的中药,优化提取纯化工艺,可加大利用率,提高经济和社会效益。
蒲公英购自安徽井泉中药股份有限公司;单咖啡酰酒石酸、绿原酸、菊苣酸、咖啡酸(纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司;NKA-2、NKA-9、HPD-450、DA201、AB-8大孔树脂购自北京索莱宝科技有限公司;Agileant-XDA-8 C18柱购自安捷伦科技有限公司;超纯水、蒸馏水自制;甲醇、乙腈为色谱级;其余试剂为分析纯。
岛津DGU-20A3R高效液相色谱仪;UV-1800PC型紫外可见分光光度计;ES1035A型电子分析天平;FRQ-1010HT型数控超声波清洗机;KMD型加热套;Spring-R30型超纯水仪。
①色谱条件
色谱条件:流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸-0.04%三乙胺-0.02%二正丁胺溶液,梯度洗脱(0~4min 5%~10%A;4~12min 10%~20%A;12~21min 20%~40%A;21~23min 40%~50%A;23~24min 50%~5%A;24~29min 5%A),流速1.0mL·min-1,检测波长为328nm,柱温35℃,进样量10μL。
②对照品与供试品的制备
精密称取菊苣酸、咖啡酸、绿原酸与单咖啡酰酒石酸对照品于容量瓶中,70%甲醇超声后定容至刻度;另精密吸取对照品储备液置于同一量瓶后定容,制成含菊苣酸、咖啡酸、绿原酸与单咖啡酰酒石酸83.62μg/mL,20.36μg/mL,9.46μg/mL和101.8μg/mL的混合对照品。取蒲公英提取物于容量瓶中,加入70%甲醇超声15min后定容,取续滤液作为供试品溶液。
③系统适用性研究
精密吸取“2.1.2”项下制备的混合对照品与供试品溶液,于“2.1.1”项下色谱条件下进样并记录色谱图1。
图1 HPLC对照品
④线性关系考察
精密量取混合对照品1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL置20mL容量瓶后定容,进样1次。以质量浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y)绘制。单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的回归方程分别为:y1=14700x-11272(R1=0.9997)、y2=80568x-3794.9(R2=0.9992)、y3=58958x+12381(R3=0.9996)和y4=24413x-14939(R4=0.9998)。结果表明,单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸质量浓度分别5.09~50.9μg,0.47~4.73μg,1.02~10.18μg和4.18~41.81μg的范围内线性关系良好。
⑤精密度试验
取同一份对照品溶液,按“2.1.1”项色谱条件重复进样6次,记录峰面积,计算单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸峰面积的RSD分别为0.27%,0.86%,0.21%,1.65%(n=6),RSD<2%,符合规定,表明仪器精密度良好。
⑥稳定性试验
取同一份供试品溶液,室温下放置0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h后分别进样,单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸RSD分别为1.72%,0.46%,0.07%,0.16%(n=8),RSD<2,符合规定,说明24h内稳定性良好。
⑦重复性试验
取同一份供试品溶液平行制备6份,分别进样1次,计算单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的含量和RSD为1.57%,1.48%,1.03%,1.80%,RSD<2%,表明该方法重复性良好。
⑧回收率试验
精密称取1mL蒲公英纯化物,共6份,并加入单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸对照品储备液,按“2.1.2”项下方法制备加样供试液,进样1次,计算加样回收率。结果得单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的平均回收率为100.97%,97.46%,101.54%,99.62%,RSD分别为0.85%,1.76%,0.93%,0.32%,该方法准确度好。
①树脂的预处理与上柱液的制备
将NKA-2、NKA-9、HPD-450、DA201、AB-8树脂用95%乙醇浸泡24h,充分溶胀后湿法装柱,用95%乙醇洗脱直至流出液无白色浑浊后,水洗至无醇味。取40g蒲公英热水提取,第一次加水15倍,提取1.5h,第二次加水12倍,提取1h,合并滤液,即得。
②大孔吸附树脂筛选
锥形瓶中加入20mL大孔树脂与40mL上柱液,室温震荡24h,测定续滤液、乙醇洗脱液中单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸和菊苣酸的量,计算吸附率、解吸率、吸附量,以菊苣酸和单咖啡酰酒石酸为主比较,结果如表1、表2所示,优选DA201树脂。
表1 5种大孔树脂的吸附率(%)与吸附量(μg/mL)
表2 5种大孔树脂的解吸率(%)
③最大吸附量考察
取树脂25mL,上柱液150mL,以2.0BV·h-1流速进行吸附,分段收集流出液,每5mL测定蒲公英总有机酸的峰面积,以编号为横坐标,计算质量浓度为纵坐标,绘制泄露曲线。结果如图2所示,在第22份出现明显的泄露行为,除去残留水体积14mL,总上柱量为96mL,即1mL DA201树脂可以吸附3.8mL的蒲公英提取液。
④吸附流速考察
取DA201树脂25mL,上柱液100mL,分别以0.5BV·h-1、1.0BV·h-1、1.5BV·h-1、2.0BV·h-1、3.0BV·h-1流速进行吸附。收集流出液后,检测4种有机酸的峰面积,计算有机酸含量与吸附率。结果如表3所示显示,随着流速加快,吸附率越小,表明树脂交换率下降,流速过慢则时间成本增加,不利于工厂生产,故选1.5BV·h-1为最佳流速,即保障有机酸富集量最大又提高效率。
表3 不同吸附流速下的吸附率(%)比较
⑤洗脱流速的考察
取上样液按照最佳条件吸附后,用3BV 50%乙醇以1.0BV·h-1、2.0BV·h-1、3.0BV·h-1、4.0BV·h-1、5.0BV·h-1流速进行洗脱,收集解吸液,按照“2.1.2”项目下进行制样,测定蒲公英4种有机酸含量,计算解析率。结果显示,4种有机酸含量先增加后降低,解析率随洗脱流速的加大而下降,结合提取效率与结果综合分析,2.0BV·h-1为最优洗脱流速。
⑥洗脱溶剂浓度考察
取大孔树脂并按上述条件吸附后,将30%、50%、80%、95%乙醇以2.0BV·h-1流速进行洗脱,用量为3BV,测定洗脱液里各有机酸含量。如表4所示,乙醇浓度为80%时,洗脱物中总有机酸含量最高。
表4 5种大孔树脂解吸液的浓度(mg/g)
⑦洗脱溶剂体积考察
取DA201树脂吸附后,用10BV 80%的乙醇进行洗脱,流速2.0BV·h-1,每1BV分段收集,测定菊苣酸的含量并计算累计解析率,以流份为横坐标,累积解吸率为纵坐标作解吸曲线。由图2可知,5BV的乙醇可将有机酸基本解吸完全,确定洗脱液体积5BV。
图2 总有机酸的泄露曲线
图3 菊苣酸的泄露曲线
⑧验证实验
取25mL DA201树脂和125mL提取液,以1.5BV·h-1流速进行吸附和4BV水洗后,最后用5BV 80%乙醇以2BV·h-1的流速洗脱,平行3次。菊苣酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、绿原酸平均质量浓度分别为2.8752mg/g、0.8167mg/g、0.3407mg/g、0.1469mg/g,有效成份大幅提高,吸附与洗脱良好。
我国蒲公英分布广泛、产量大、价廉易得,对其提取分离纯化工艺进行优化,加大其利用率,可以提高其经济效益。本实验以蒲公英4种有机酸为指标,优选DA201大孔树脂,上样体积为4BV,吸附流速为1.5BV·h-1,4BV洗涤用水量,5BV 80%乙醇以2.0BV·h-1的流速洗脱,纯化后,4种有机酸含量大幅提升,效果良好。