烟草青枯病病株根际土壤可培养细菌多样性特征分析

申云鑫，沈广材，包玲凤，濮永瑜，张 庆，周旭东，尹兴盛，张荣琴，陈齐斌，何永宏，杨佩文

(1.云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；2.云南省农业科学院农业环境资源研究所，昆明 650205；3.云南省烟草公司保山市公司，云南 保山 678000)

【研究意义】烟草青枯病是由茄科青枯菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种毁灭性病害，病害的发生发展与土壤微生物相互作用的变化以及微生物群落失衡密切相关。近年来，随着连作年限的增加，化肥和化学农药的长期使用，导致烟草青枯病流行和蔓延的速度加快，严重田块发病率达100%，已造成巨大的经济损失[1]。土壤微生物群落具有能通过复杂的相互作用抑制土传疾病的能力，通过人为调控土壤微生物群落，建立免疫型根际土壤微生态环境防控烟草青枯病已成为关注的焦点[2]。【前人研究进展】作物根茎类病害的爆发与土壤微生物群落结构和功能多样性密切相关，充分利用微生物群落结构和微生物功能多样性是实现作物根茎类病害持续有效绿色防控的有效措施[3]。相关研究表明，具有高微生物群落多样性的根际土壤可降低烟草青枯病暴发的几率[4]。具有较高多样性的根际土壤往往比微生物群落单一的根际土壤更不容易受到病原菌的入侵[5]。微生物群落多样性高、微生物食物网多样化等特点是构建健康的土壤的关键，土壤中的有益微生物类群可通过捕食、竞争和寄生等多种方式将病原菌相对丰度控制在较低的水平之下[6]。土壤微生物类群在维持生态系统稳定中发挥重要作用时，它们能促进复杂、模块化的微生物群落网络的形成，从而使土壤具有抑制病原菌的作用，具有类似“健康”分支微生物群落结构的土壤可能抑制根茎类病害的爆发[7]。土壤中有些微生物种群具有分泌抗生素或抗菌蛋白的能力，对植物病原菌表现出广泛的生物效应，并应用于控制多种作物病害；土壤有些细菌种群在作物根系的微生态环境中对物质和能量的转化起重要作用，还与病原菌竞争养分，产生抗生素和胞外酶；许多放线菌显示出防控作物病害能力；土壤微生物群落能通过与病原菌争夺营养、抑制病原菌或诱导植物产生抵抗病原菌的化合物从而减少病原菌的入侵[8-10]。土壤微生物群落与病原菌之间存在着明显的生态效应，对病原菌的抑制在一定程度上是土壤微生物的群体作用；土壤中的有益微生物类群与病原菌竞争时可以产生多种抑菌物质，或者完全占据根际土壤有限的生长空间和物质，从而有效抑制病原菌的生长，抑制病害爆发[11-12]。【本研究切入点】烟草青枯病的发生发展可能与土壤微生物物种组成、丰度和功能变化相关，通过分析健康烟株和患病烟株根际土壤可培养细菌种群结构组成和多样性，明确具有差异性的细菌种群，为烟草青枯病的生物防控提供菌种资源。本研究拟分别采集云南省保山市2个碱性土壤县(区)的患病与健康烟株根际土壤，采用稀释涂布平板法获得可培养细菌种群，基于Illumina MiSeq高通量测序，解析健康烟株和患病烟株根际土壤可培养细菌种群结构组成和多样性特征。【拟解决的关键问题】通过研究可培养细菌种群变化与烟草青枯病发生发展之间的关系，为利用土壤微生物群落多样性防控烟草青枯病提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

采样地点位于保山市隆阳区和施甸县，每个县(区)选择5个乡(镇)，每个乡(镇)选择3个村，共30个样点。每个样点选择烟草青枯病典型发病地块，分别采集5株典型患病烟株和5株健康烟株的根际土壤样品，并混合为1个土壤样品。每个土壤样品分为2部分，一部分土样置于50 mL 的无菌管里，带回实验室做土壤细菌种群培养；另一部分土样过40 目筛后放入自封袋中，做好标记，待自然风干后于实验室土壤理化性质分析测定。

1.2 土壤样品主要理化性质测定

分析测定土壤样品主要理化性质，包括pH、有机质、全氮、全磷、全钾、水解性氮、有效磷、速效钾、交换性钙、交换性镁、有效铜、有效锌等有效硼指标，测定方法参照鲁如坤[13]的方法。

1.3 土壤样品细菌种群分离培养

1.3.1 供试培养基 细菌的培养采用NA培养基，具体为牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 15～20 g，加蒸馏水至1000 mL，调pH至7.0～7.2，121 ℃高压灭菌20 min。

1.3.2 培养方法 每个土壤样品取2 g置于198 mL无菌水中(500 mL锥形瓶加玻璃珠)，摇床25 ℃震荡培养(180 r/min)1 h左右，静置2～3 min，取上清液梯度稀释至10-3、10-4、10-5，每个浓度3次重复，充分摇匀后吸取0.2 mL均匀涂布于NA平板上，然后倒置于恒温箱内37 ℃培养5～10 d。待其菌落数量不再增加，每个平板用无菌水5 mL洗脱菌落，同一样本的9个平板洗脱至同一个无菌离心管中。最后再将隆阳区的15个患病烟株根际土壤样品以等体积混合为1个样品(LY.B)，15个健康烟株根际土壤样品以等体积混合为1个样品(LY.J)；施甸县的15个患病烟株根际土壤样品以等体积混合为1个样品(SD.B)，15个健康烟株根际土壤样品以等体积混合为1个样品(SD.J)。

1.4 土壤样品细菌种群Illumina MiSeq高通量测序

采用试剂盒进行样品DNA抽提，并利用 Thermo Nano Drop One 检测纯度和浓度，使用带 barcode 的特异引物及TaKaRa Premix Taq-Version 2.0(TaKaRa Biotechnology Co.，Dalian，China)对V3～V4区进行PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的片段长度和浓度，按照 NEB Next®UltraTMII DNA Library Prep Kit for Illumina®(New England Bio labs，USA)标准流程进行建库操作，使用 Illumina Nova 6000 平台对构建的扩增子文库进行 PE250 测序[14]。

1.5 数据处理与统计分析

利用UPARSE聚类方式，基于97%的序列相似度进行OTU归并和划分得到OUT表，基于OTU丰度表，进行α多样性指数以及群落组成分析，以上均在广东美格基因科技有限公司云平台(美格云平台,magigene.com)完成。

2 结果与分析

2.1 土壤样品主要理化性质分析

如表1所示，各样品pH为6.54～7.48，有机质22.63～24.67 g/kg，全氮1.40～1.57 g/kg，全磷1.10～1.39 g/kg，全钾13.56～19.50 g/kg，水解性氮90.91～139.62 mg/kg，交换性钙17.35～25.82 cmol/kg，交换性镁4.97～10.66 cmol/kg，有效铜2.13～2.73 mg/kg，有效铁9.73～30.23 mg/kg，有效锰10.35～33.77 mg/kg，患病和健康土壤中具有显著差异性(P<0.05)；有效磷43.21～80.00 mg/kg，速效钾441.17～499.44 g/kg，有效锌3.85～4.68 mg/kg，有效硼0.39～1.43 mg/kg，其在病土中的含量高于健康土，且速效钾在患病和健康土壤中具有显著差异性(P<0.05)。

表1 土壤理化指标分析

2.2 烟株根际土壤细菌种群α多样性分析

在对原始序列文库进行质量评价后，利用热测序技术对细菌16S rRNA基因的V3～V4区进行检测。12个土壤样品，均一化每样本79 629条高质量细菌序列，聚为2668个不同的细菌操作分类单元(Operational Taxonomic Units, OTUs)。SD.J与SD.B所含OUT数分别为690、725个，共有的OT有456个，LY.J与LY.B样品分别有OUT数573、683个，共有的OUT 361条(图1)。原始测序数据经拼接，并按97%的序列相似性进行划分，LY.B共有OUT 684个，隶属于6个门，10个纲，34个目，58个科，128个属和49个种。LY.J共有OUT 569个，隶属于6个门，11个纲，32个目，58个科，125个属和47个种。SD.B共有OUT 691个，隶属于7个门，11个纲，33个目，57个科，115个属和47个种。SD.J共有OUT 724个，隶属于8个门，12个纲，36个目，69个科，1325个属和54个种；α多样性指数结果均无显著差异(图2)。

图1 共有及特有OTU venn图

图2 α多样性指数柱状图

2.3 烟株根际土壤细菌种群门和纲分类水平组成分析

在门分类水平上，层次聚类分析表明各采样地的细菌群落组成相似(图3)，根据物种注释结果，可培养细菌优势门有4大类(图4)，按比例大小依次为变形菌门(Proteobacteria，54.97%～71.47%)、厚壁菌门(Firmicutes，11.19%～37.69%)、放线菌门(Actinobacteria, 2.79%～21.09%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，1.88%～16.73%)，占总原核微生物群落的99.55%～99.83%。相对于健康烟株根际土壤，患病烟株根际土壤中Proteobacteria的相对丰度提高9.30%～22.63%，Bacteroidetes的相对丰度提高5.17%～57.73%；而Firmicutes的相对丰度降低5.39%～39.93%，放线菌门的相对丰度降低30.35%～41.04%。

图3 门分类水平UPGMA聚类树

图4 门分类水平可培养细菌种群组成

在纲的分类水平上，层次聚类分析表明各采样地的细菌群落组成相似(图5)，根据物种注释结果，检测到的可培养细菌优势纲有4大类(图6)，按比例大小依次为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria54.74%～71.38%)、杆菌纲(Bacilli，11.36%～39.95%)、放线菌纲(Actinobacteria, 2.78%～30.38%)和拟杆菌纲(Bacteroidia，1.88%～5.17%)，占总原核微生物群落的99.46%～99.71%；与健康烟株根际土壤相比，患病烟株根际土壤中Gammaproteobacteria的相对丰度提高9.25%～22.79%，Bacteroidia的相对丰度提高5.17%～57.73%；Bacilli的相对丰度降低5.07%～39.95%，Actinobacteria的相对丰度降低30.38%～41.02%。

图5 纲分类水平UPGMA聚类树

图6 纲分类水平可培养细菌种群组成

2.4 烟株根际土壤细菌种群属分类水平组成分析

在属分类水平显示出相对丰度大于1%的属，如图7所示，可培养细菌优势属为假单胞菌属(Pseudomonas，7.12%～32.71%)、无色杆菌属(Achromobacter，0.71%～25.77%)、赖氨酸芽胞杆菌属Lysinibacillus，1.08%～10.88%)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter，2.10%～18.35%)、剑菌属(Ensifer，0.94%～7.76%)、土壤芽孢杆菌属(Solibacillus，1.18%～3.14%)。与健康烟株根际土壤相比，患病烟株根际土壤Pseudomonas、Achromobacter和Ensifer的相对丰度提高了15.60%～226.10%、71.30%～75.99%和13.98%～191.30%；Pseudarthrobacter、Lysinibacillus和Solibacillus的相对丰度降低了20.87%～45.59%、15.63%～90.10%和5.63%～16.20%。

图7 属分类水平上的可培养细菌种群丰度聚类热图

基于LEfSe分析，查找各水平上具有显著差异的细菌种群(P<0.05)，如图8所示，健康烟株根际土壤中差异显著的细菌种群为鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、苯基杆菌属(Phenylobacterium)、假诺卡氏菌目(Pseudonocardiales)和假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)；患病烟株根际土壤中差异显著的细菌种群为Chitinophaga_sp__MHS12、Azospirillaceae、Azospirillum和Flavitalea。

图8 基于 LEfSe 分析的细菌群落组间差异分析

2.5 烟株根际土壤微生物群落与环境因子之间的相关性

土壤细菌优势门与土壤理化性状相关性分析结果表明(表2)，Proteobacteria与有效磷、速效钾、有效硼含量呈显著正相关，Firmicutes与pH、全钾含量呈显著正相关，与全磷、有效磷、速效钾、有效锰、有效硼含量呈显著负相关，Actinobacteria与pH、全钾含量呈显著负相关，与有效锰、有效硼含量呈显著正相关。

表2 优势门丰度与土壤理化因子之间的相关性

3 讨 论

3.1 根茎类病害患病土壤主要理化性质特征

土壤环境因子是影响作物根茎类病害发发展生的重要因素，病原菌侵染显著受到土壤理化性质、温湿度等非生物因素和生物因素的制约，土壤理化因子是影响土壤微生物区系的重要因素，土壤微生物的群落结构组成与变化在很大程度上与土壤理化性质的变化相关[15]。土壤pH通过作用于病原菌影响其侵染过程，同时影响其他微生物种群的生长繁殖而调节其群落结构，而且通过影响土壤的速效养分的转化而影响病原菌和其他微生物的群落结构[16]；土壤有机质、大量元素和中微量元素等养分指标的含量在很大程度上也影响着作物健康植株和患病植株根际微生物的塑造过程[17]。本研究中，由于健康烟株和患病烟株根际土壤采集自同一烟地，施肥管理水平一致，可能导致土壤中pH、有机质、全氮、全磷、全钾、水解性氮、有效磷、交换性钙、交换性镁、有效铜、有效锌和有效硼等养分指标含量差异性不显著，但速效钾含量在患病和健康土壤中具有显著差异性，其含量对烟草青枯病的发生发展的影响需进一步的研究验证。

3.2 土壤微生物多样性特征与根茎类病害防控机制

作为作物根茎类病害生物防治的贡献者，土壤中真菌、细菌及放线菌中的有益类群通过拮抗作用抑制或直接杀死病原菌的菌丝及孢子，从而降低作为根茎类病害的发生发展，土壤中含有更加丰富、均匀、多样性高的有益微生物群落结构，对作物根茎类病害就具有更强的综合防治能力[18-19]。细菌在植物根系的微生态环境中，不但对物质和能量的转化起重要作用，还与病原菌竞争养分，产生抗生素和胞外酶[20-21]。放线菌在其生长过程中分泌的抗生素可以抑制其他有害病原微生物的生长。土壤中含有更大比例的有益真菌类群，有助于土壤生态系统更加稳定，增强土壤抑制土传病原菌的能力[22]。由于特定的土壤生态环境具有特定的微生物群落结构，不同地域的土壤具有不同的微生物种群和群落结构，病原菌入侵不同作物和不同病害引起群落结构变化的结果不同[23]。

患病与健康土壤细菌群落结构间的差异可能是影响烟草青枯病发生发展的促进因素。通过对比健康植株和患病植株土壤根际微生物有显著差异的种群，从而寻找到有效的与土壤抑病或感病相关的微生物种群。本研究结果表明，与健康烟株相比，在门分类水平上，患病烟株根际Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度提高，Firmicutes和Actinobacteria的相对丰度降低；在纲分类水平上，Gammaproteobacteria和Bacteroidia的相对丰度提高；Bacilli和Actinobacteria的相对丰度降低；在属的分类水平上，Pseudomonas、Achromobacter和Ensifer的相对丰度提高；Pseudarthrobacter、Lysinibacillus和Solibacillus的相对丰度降低。

健康烟株根际与患病烟株根际富集存在显著差异的细菌种群，该物种数发生变化可能是导致病害发生的重要因素。Sphingomonadales、Sphingomonadaceae、Phenylobacterium、Pseudonocardiales和Pseudonocardiaceae是健康烟株根际土壤中富集的细菌种群，而Chitinophaga_sp__MHS12、Azospirillaceae、Azospirillum和Flavitalea则是患病烟株根际土壤中富集的细菌种群。健康土壤中丰度显著增加的Sphingomonadales、Sphingomonadaceae、Phenylobacterium、Pseudonocardiales和Pseudonocardiaceae等种群具有促进养分转化吸收和分泌糖肽类抗生素的生物学功能；患病土壤中丰度显著增加的Chitinophaga_sp_MHS12、Azospirillaceae、Azospirillum和Flavitalea等种群具有促进养分转化吸收和分泌糖肽类抗生素的生物学功能[24]；分解几丁质、葡萄糖、果糖、麦芽糖及甘露醇等生物学功能，可能与烟草植株受到青枯病菌侵染后在其根际募集大量微生物来抵御原病菌侵染有关[25-26]；但这些有差异的种群能否指导青枯病的发生检测和生物防控调控还须进行深入、全面地研究和验证。通过从健康烟株根际土壤中分离和筛选与抗病相关的微生物种群，可为烟草青枯病生物防治提供微生物资源支持。

健康土壤微生物多样性高，物种之间的物质交换和转化途径多样化，从而维持生态平衡；利用健康土壤中丰度较高的优势种群抑制病原微生物的生长，实现病害防控。本研究只是对健株和感染青枯病烟草株根际可培养细菌种群多样性及组成进行了初步比较分析，在后续研究中，将对可培养真菌种群多样性及组成开展研究，以进一步揭示烟草青枯病害发生发展与微生物区系之间的关系。

4 结 论

健康烟株和患病烟株根际土壤可培养细菌的OUT数量和α多样性指数间差异性不显著。与健康烟株相比，在门分类水平上，患病烟株根际Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度提高，Firmicutes和Actinobacteria的相对丰度降低；在纲分类水平上，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和拟杆菌纲(Bacteroidia)的相对丰度提高；杆菌纲(Bacilli)和放线菌纲(Actinobacteria)的相对丰度降低；在属的分类水平上，假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)和剑菌属(Ensifer)的相对丰度提高；假节杆菌属(Pseudarthrobacter)、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)和土壤芽孢杆菌属(Solibacillus)的相对丰度降低。鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、苯基杆菌属(Phenylobacterium)、假诺卡氏菌目(Pseudonocardiales)和假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)是健康烟株根际土壤中富集的细菌种群，而Chitinophaga_sp__MHS12、Azospirillaceae、Azospirillum和Flavitalea则是患病烟株根际土壤中富集的细菌种群。健康与患病植烟土壤烟株根际可培养细菌群落呈分化趋势，烟草青枯病的发生发展可能与烟株根际细菌种群丰度变化有关，通过调控土壤微生物群落结构可实现作物根茎类病害持续有效绿色防控。