槟榔间作香露兜模式下土壤微生物区系分析

张 昂，钟壹鸣,2，鱼 欢，吉训志，宗 迎，贺书珍，秦晓威

(1.中国热带农业科学院香料饮料研究所/海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室/农业农村部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室，海南 万宁 571533；2.热带特色林木花卉遗传与种质创新教育部重点实验室/海南大学林学院&热带作物学院，海口 570228)

【研究意义】槟榔(ArecacatechuL.)作为海南出产的重要中药材，已成为海南重要经济支柱之一[1]。随着槟榔种植面积的不断扩大，对传统单作槟榔林土壤健康的保育以及发展槟榔林下经济的研究显得更加紧迫。香露兜(PandanusamaryllifoliusRoxb.)作为一种新兴草本香料植物，耐荫蔽，好种养，开发前景广阔，适宜在槟榔林下种植[2-3]。发展槟榔林下间作香露兜既能够合理配置光、温、水、肥等资源，改善作物生长环境、保持生物多样性和稳定性、控制病虫害发生以及维护槟榔林生态系统相对稳定[4-6]，又能够提高农户综合收益，实现经济效益与生态效益有机统一与协同发展，成为发展槟榔林下复合种植模式的重要方案之一。因此明确槟榔间作香露兜模式下土壤健康维持机制，对促进槟榔与香露兜产业可持续发展意义重大。【前人研究进展】刘涌鑫[7]与杨雅丽等[8]对热带地区玉米等作物农田生态系统的研究表明土壤微生物是土壤有机质分解、养分转化等过程的关键驱动因素，在热区农田生态系统中发挥着重要作用。Li等[9]和Huang等[10]通过监测小麦和土豆等作物根系与土壤互作关系时发现土壤微生物群落多样性与作物根系健康密切相关，维持土壤微生物群落结构平衡与稳定是保障热区农田生态系统可持续发展的前提条件。隋鑫[11]和郝海平等[12]的通过对农田保护性耕作或间作等模式的研究发现，土壤微生物群落对土壤扰动和外界环境的变化非常敏感，尤其是间作模式的变化能够通过调控土壤微生物群落结构显著改变土壤生态功能。Dong等[13]在对水稻不同管理模式的研究也证实了土壤微生物群落结构对种植模式或管理方式响应的敏感性较高。梁文举等[14]和Yang等[15]的前期研究认为土壤微生物群落组成与多样性作为表征土壤质量和健康的早期指标，探究土壤微生物区系对耕作模式变化的响应规律是农田健康研究的关键内容之一。然而，目前针对岛屿型热带农田间作系统对土壤微生物区系的影响机制方面的研究较少，而热带地区经济作物的经济寿命较长，而长期连作可能会导致土壤菌群失衡及连作障碍，例如钟壹鸣[16]、颜彩缤[17]、庄辉发[18]等通过对槟榔间作香露兜、平托花生及香草兰等作物的研究发现，随着槟榔连作时间增加，土壤微生物多样性和活性均出现降低趋势，但在槟榔林下间作经济作物不仅能够显著提高槟榔林土壤微生物丰度与多样性，还能够改善土壤代谢功能，从而促进槟榔根系对营养元素的有效吸收，为维持槟榔林土壤微生物区系以及土壤健康保育供理论依据和技术支撑。【本研究切入点】为探究槟榔林下间作香露兜模式对槟榔林土壤微生物区系的影响，应用Illumina HiSeq高通量测序技术分析土壤细菌和真菌组成与多样性，比较不同种植模式下土壤微生物区系的变化，并结合相关的土壤理化性质变化，明确土壤微生物群落演替与土壤理化性质之间的内在关系。【拟解决的关键问题】揭示槟榔林下间作香露兜对土壤微生物群落组成与多样性的影响及其关键调控机制，为优化槟榔栽培技术以及槟榔林土壤保育技术的开发提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

本试验位于海南省陵水县文罗镇三角威村(109°56′E，18°31′N)，该试验地区海拔36 m，年均温25.2 ℃，年均降水量1500～2500 mm。该区域位于亚热带与热带的过度地带，全年光照充足，降水集中在夏季。土壤类型主要为砖黄壤。试验地为多年单作槟榔，槟榔间作香露兜开展于2019年，香露兜单作样地于同期设置于该样地。

1.2 试验设计

试验采取随机区组设计，设置槟榔单作(DB)、香露兜单作(DX)和槟榔间作香露兜(JZ)3种种植模式。槟榔与香露兜株行距均分别为2.5 m×2.5 m和50 cm×50 cm，试验期间各个处理的水肥管理、病虫害防治等田间管理方式保持一致。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤取样及理化性质测定 大田试验开始于2020年6月，每块样地按照S形使用土钻采集9个重复表层土样，然后每3个土样混合成一份，最终为3个复合样品。土壤样品过2 mm筛，移除根系和杂物。每个样品分为2个部分：一部分土壤自然风干7～10 d，过筛(1 mm)后用于土壤化学性质的测定。pH使用FE28型pH计测定; EC(Electric conductivity)使用DDS-307A型电导率仪测定; 有机质(Soil organic matter, SOM)采用总有机碳分析仪(Multi N/C 3100)测定; 碱解氮(Alkali hydrolyzed nitrogen, SAN)采用碱解扩散法测定; 速效磷(Soil available phosphorus, SOP)采用紫外分光光度计法测定; 速效钾(Soil available potassium, SAK)采用火焰光度计法测定。

1.3.2 土壤微生物取样及测序 土壤样品的另一部分装入50 mL离心管，置于-80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物群落组成和多样性测定。土壤总DNA的提取采用DNA提取试剂盒提取和纯化：利用标记有barcode的引物序列(细菌：967F/1046R；真菌：ITS1F12/ITS2)扩增相应土壤细菌16S rRNA V3～V4区片段和真菌ITS-1序列片段，使用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物片段长度，根据定量检测结果，将扩增产物混合为一个样本，然后构建克隆文库；根据库检结果计算每个文库的上样量，用双末端测序方法利用Illumina MiSeq高通量平台进行测序。

1.4 数据处理

采用SAS v8软件进行单因素方差分析土壤理化性质、细菌丰富度、细菌多样性指数、真菌丰富度、真菌多样性指数等土壤微生物群落指标，使用邓肯检验进行多重比较，用于比较不同种植模式间的指标存在显著差异(P<0.05)；使用CANOCO 5.0软件进行冗余分析(RDA)，用于明确影响土壤微生物群落结构的主要环境因子，分析过程中选择manual forward selection程序以使用具有499个排列的蒙特卡罗测试来确定环境变量参数的显著性。Spearman的等级相关性分析用于测试土壤微生物优势群落与土壤理化性质之间的关联。使用Origin 9.1和R 4.0.3进行数据绘图。

2 结果与分析

2.1 不同种植方式对土壤理化性质的影响

3种不同种植模式不影响土壤温度和容重；香露兜单作模式下的土壤水分相比槟榔单作显著提高3.01%(P<0.05)，而相比于槟榔单作和香露兜单作，间作的土壤水分含量没有显著变化；间作模式下的土壤pH相比槟榔单作显著提高0.91(P<0.05)，却相比香露兜单作显著降低0.60(P<0.05)；间作模式下的土壤有机质含量相比香露兜和槟榔单作分别显著降低50.61%和42.12%(P<0.05)；间作模式下的土壤速效钾含量相比香露兜单作和槟榔单作分别显著降低75.75%和55.74%(P<0.05)；间作模式下的土壤速效磷含量相比槟榔单作显著降低35.91%(P<0.05)，与香露兜单作相比差异不显著；间作模式下的土壤速效钾含量相比香露兜单作和槟榔单作分别显著降低58.33%和36.71%(P<0.05，表1)。

表1 不同种植模式对土壤理化性质的影响

2.2 不同种植方式对土壤微生物结构的影响

槟榔单作土壤的细菌丰富度相比于香露兜单作和槟榔间作香露兜分别显著降低30.31%和37.52%(P<0.05)，香露兜单作与间作的细菌丰富度之间不存在显著差异(图1-a)；槟榔单作土壤的细菌多样性指数(香农威纳指数)相比于香露兜单作和槟榔间作香露兜分别显著低11.50%和8.52%(P<0.05)，香露兜单作与间作的细菌多样性指数之间不存在显著差异(图1-c)；不同种植模式下的细菌多度不存在显著差异(图1-e)。真菌丰富度、多样性指数与多度在3种种植模式下不存在显著差异(图1-b、1-d、1-f)。

DB:槟榔单作; JZ:槟榔间作香露兜; DX:香露兜单作

2.3 不同种植方式对土壤微生物区系结构的影响

由图2-a可知，在所有土壤样品中细菌群落的优势菌门是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。变形菌门的相对多度均值为22.59%，在3种种植模式中相对多度范围分别为20.70%～25.29%；酸杆菌门的相对多度均值为19.60%，在3种种植模式中相对多度范围分别为11.34%～19.00%；放线菌门的相对多度均值为16.66%，在3种种植模式中相对多度范围分别为20.89%～22.73%；厚壁菌门的相对多度均值为16.11%，在3种种植模式中相对多度范围分别为6.70%～28.49%。由表2可知，相比于槟榔单作，槟榔间作香露兜和香露兜单作分别显著提高酸杆菌门多度75.09%和72.48%(P<0.05)，却分别显著降低厚壁菌门多度75.42%和61.70%(P<0.05)；香露兜单作的变形菌门多度相较于槟榔单作和间作显著提高42.71%和34.42%(P<0.05)，而间作与香露兜单作模式之间的其他土壤优势菌门多度不存在显著差异。

图2 不同处理土壤微生物群落在门水平的组成和相对多度

表2 不同种植模式对土壤优势菌门多度的影响

由图2-b可知，槟榔单作、香露兜单作和槟榔间作香露兜模式中真菌群落的优势门均是子囊菌门(Ascomycota)，相对多度范围为82.00%～93.07%，相对多度均值为90.58%，各耕作模式下的子囊菌门物种多度之间不存在显著差异(表2)。

2.4 土壤理化性质与土壤微生物相关性分析

土壤微环境与土壤微生物的相关性分析(图3)表明，细菌丰富度与pH(R2= 0.807，P<0.01)呈显著正相关，却与速效钾(SAK)(R2= 0.954，P< 0.001)、速效磷(SOP)(R2= 0.920，P<0.001)、碱解氮(SAN)(R2= 0.960，P<0.001)呈显著负相关；细菌多样性指数与pH呈显著正相关(R2= 0.738，P<0.05)，却与速效钾(R2= 0.916，P<0.001)、速效磷(R2=0.836，P<0.01)、碱解氮(R2= 0.927，P<0.001)呈显著负相关。真菌丰富度与多样性指数和上述土壤指标之间不存在相关性。

“*”表示 P < 0.05，“**”表示P< 0.01，“***”表示 P < 0.001；“BR”表示细菌丰富度，“BD”表示细菌多样性指数，“FR”表示真菌丰富度，“FD”表示真菌多样性指数

细菌群落结构与土壤理化性质之间的关系(图4-a)表明，RDA的前两个排序轴分别解释了总方差的78.36%和15.69%；蒙特卡洛置换检验(表3)表明，土壤碱解氮(F=9.60，P=0.006)、速效钾(F=8.20，P=0.018)、速效磷(F=12.9，P=0.012)和pH(F=10.5，P=0.014)对细菌群落结构的影响显著，依据解释变量矩阵(环境变量数据)的约束排序结果，表明影响微生物群落结构的环境因子顺序为SOP>pH>SAN>SAK>SM>SOM>SBD>ST。真菌群落结构与土壤理化性质之间的关系(图4-b)表明，RDA的前两个排序轴分别解释了总方差的70.58%和26.45%；影响大小顺序为SOM>SAK>SAN>pH>SOP>SM>SBD>ST。

图4 土壤细菌多样性(a)、真菌多样性(b)与土壤理化特性的冗余分析(RDA)

表3 环境因子对土壤微生物群落分布的贡献及其显著性

此外，Spearman等级相关分析表明土壤理化特性显著影响了微生物群落组成。在细菌群落组成中，变形菌门的多度与pH和SM呈显著正相关(P<0.05)，与SAK、SOP和SAN呈显著负相关(P<0.05)；酸杆菌门的多度与pH和SM呈显著正相关(P<0.05)，与SOP呈显著负相关(P<0.05)；厚壁菌门多度与SAK、SOP和SAN呈显著正相关(P<0.01，图5-a)。对真菌群落而言，真菌的子囊菌门对环境因子的变化不敏感；担子菌门的多度与SBD、SAK、SOP和SAN呈显著正相关，与pH和SM呈显著负相关。由此可知土壤碱解氮、速效磷和速效钾等养分含量是改变微生物群落组成的主要因素(图5-b)。

“*”表示 P < 0.05，“**”表示 P < 0.01，“***”表示 P < 0.001

3 讨 论

3.1 槟榔间作香露兜对土壤理化性质的影响

长期单作引起土壤肥力改变，且土壤有机质含量随树龄的增加而急剧减少[19]。一般认为间作模式能够显著提高土壤有机质含量[20-21]，但在本研究中，槟榔林下间作香露兜显著降低土壤有机质含量可能与间作显著改善槟榔林土壤偏酸的环境以及海南岛的常年高温，加速有机质的分解速率有关[22-23]。王燕等[24]研究发现，合理的间套种不仅能提高复种指数和土地利用率，还能够促进作物根系生长。槟榔间作咖啡、胡椒与花生等体系均显著促进作物根系生长，增加单位面积根系密度[25]，而作物根系生物量的增加显著提高土壤养分利用效率[26]，引起土壤养分含量的下降。刘晓燕等[27]研究发现，在槟榔林下间作香露兜能够提高郁闭度，降低土壤水分蒸散损失，提高土壤含水量。在槟榔间作香露兜体系中，发达的作物根系能够减少有效磷在雨水淋溶下渗的损失[28-29]，因此相比于香露兜单作显著提高土壤有效磷含量。

3.2 槟榔间作香露兜对土壤微生物多样性的影响

土壤微生物群落是农田生态系统重要组成部分[30]，不仅在土壤物质循环和能量转化过程中起着重要作用，还影响土壤健康以及作物生长发育状况，甚至决定作物的产量与品质[23, 31-32]。土壤微生物能够敏感地指示气候和土壤环境条件的变化[33]，同时土壤微生物多样性受土壤养分、结构、pH、温度和水分等条件的影响[34]。本研究中，微生物多样性并不响应于土壤温湿度以及容重的变化，表明在陵水试验地区，上述土壤物理性质以及微环境并非是驱动微生物演替的主要因子。此外，土壤养分含量在微生物群落结构装配过程中同样具有重要作用，是主导微生物群落演替以及维持土壤微生物多样性的重要因子[25-27]。间作模式能够直接通过改变土壤养分含量实现对土壤微生物多样性的调控，或通过影响土壤环境因子进行间接调控。前人研究表明，在玉米—花生间作体系中，土壤有机碳、有效磷和有效钾含量显著影响土壤微生物多样性与结构组成[35]。但作物的连续单作能够引起土壤中的养分被持续消耗，加之酸性化学肥料在林地的积累导致土壤酸度的增加和有机质含量的下降，进一步使土壤养分的有效性降低，最终造成养分含量的显著下降[36]。本研究中尽管土壤有机质含量在槟榔间作香露兜后显著下降，但是土壤有机质与土壤微生物多样性相关关系的解耦表明土壤有机质在槟榔间作香露兜体系中并非是调控微生物群落的主要途径。此外，氮素是微生物生长和代谢所必须的元素，氮素缺乏有可能限制微生物的生长[37-38]。前期研究表明槟榔土壤有机质、全氮、全磷和全钾平均含量随着槟榔生长年限增加而有所下降，而土壤碱解氮、速效磷、速效钾平均含量却随槟榔生长年限增加而有所上升[39]。徐绍伟等[40]研究发现，酸性氮肥在土壤中的累积引起土壤pH显著降低，进而显著抑制相关微生物的多样性。然而本研究中，槟榔间作香露兜可能通过显著提高对酸性氮肥的消耗，造成土壤趋于中性，细菌群落丰富度和多样性指数显著增加，这与Xu[41]和郑敏娜等[42]的研究结果一致。

3.3 槟榔间作香露兜对土壤微生物区系结构的影响

槟榔间作香露兜模式显著影响土壤微生物群落组成，所有样品中土壤细菌群落中的优势种群为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。前期研究表明，变形菌门是细菌中最为庞大的菌群，具有广泛的生理代谢功能，能够适应各种复杂的环境[43-44]。变形菌门作为一种嗜营养菌，富碳环境可刺激其快速增长[45]，因此槟榔间作香露兜模式土壤中丰富的有机质为变形菌提供了充足的代谢底物，用于促进其生长和繁殖。酸杆菌门也是土壤细菌中的优势菌门之一[46]，主要功能是参与土壤有机质的分解[47]。尽管更多的研究认为土壤酸杆菌多度与土壤pH呈显著负相关[48-50]或中性关系[51]，但也有研究表明，向土壤中增施氮肥降低了酸杆菌的多度可能与施氮导致土壤pH下降有关[52]。因此本研究中间作模式提高土壤pH，可能是增加酸杆菌门多度的原因之一。此外，本研究中酸杆菌门与土壤碱解氮、速效磷和速效钾呈显著负相关，间作能够通过降低土壤速效养分含量进而显著提高酸杆菌门多度。厚壁菌门是一大类原核微生物[53]，主要由芽孢杆菌纲(Bacilli)、梭菌纲(Clostridia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、热石杆菌纲(Thermolithobacteria)及一些不确定的遗传类群组成[54]。本研究中厚壁菌门多度与土壤碱解氮、速效磷和速效钾呈显著正相关。因此，间作能够通过降低土壤速效养分含量进而降低厚壁菌门多度。

4 结 论

土壤真菌群落对不同种植模式的响应不敏感，但土壤细菌群落积极响应种植模式的变化。槟榔间作香露兜通过显著降低土壤速效磷、速效钾和碱解氮等养分含量以及提高土壤pH来抑制土壤细菌群落丰富度与多样性指数，尽管间作模式不改变细菌群落多度，却通过降低土壤养分水平显著提高酸杆菌门物种多度，同时降低厚壁菌门物种多度，进而显著改变土壤微生物群落结构。此外，间作模式下土壤细菌与真菌群落组成和丰度与香露兜单作相比无显著差异，表明香露兜是驱动土壤微生物区系组成的重要因子，在槟榔林下间作香露兜有助于改善槟榔单作土壤微生物区系，加强槟榔林土壤健康保育及相关产业可持续发展。