人凝血酶原复合物的临床前药物安全性评价

余伟，牟蕾，吴佳君，鲁涛，黄琰，洪树青，王黔川，李伟

1.成都蓉生药业有限责任公司，四川 成都 610041；2.成都生物制品研究所有限责任公司，四川 成都 610041

人凝血酶原复合物（human prothrombin complex，简称PCC）是以健康人血浆为原料，经多步离子交换层析法分离纯化和相应病毒灭活方式处理，制备的一种能促进血液凝固的血浆蛋白类凝血因子制剂。PCC 临床上除用于治疗血友病B 外，更多用于治疗因维生素K 或患肝病引起的出血性症状。药品注册管理办法（局令第28 号）明确规定：鉴于生物制品的多样性和复杂性，药理毒理方面的试验项目要求可能并不适用于所有的治疗生物制品。虽然PCC隶属于生物制品，但来源于人体血浆，使用剂量不超过生理允许剂量范围，且未进行特殊工艺处理、未使用特殊溶剂，在提出相关资料或证明后，可免报安全性研究资料。

目前，国内PCC 已具有数十年的临床使用经验，也证明了该产品的临床安全性，但不同厂家PCC 制品在制备工艺、保护剂和干热病毒灭活方式选择上仍存在一定差异，也需在临床试验前开展相应的安全性评价，以保障患者的合法权益。因此，成都蓉生药业有限责任公司（简称蓉生药业）在申报过程中基于制品的作用机制和自身特点，参考相应技术指导原则，科学、合理地进行了PCC 的药理毒理研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试品 PCC 由蓉生药业自主研发，是以健康人血浆为原料，经2 步离子交换层析法分离纯化，并经有机溶剂／ 去污剂（solvent／detergent，S／D）法和80 ℃、72 h 干热法处理，制备获得的富含人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的冻干制剂。产品批号：20130201、20130302 和20130303，质量符合人凝血酶原复合物各论要求。

1.2 实验动物 30 只SPF 级昆明系小鼠（批号：mk-20130315-178 和mk20130322-209）、12 只 清 洁 级英国种豚鼠（批号：gp20110414-034 和gp20110429-041）由成都生物制品研究所有限责任公司提供；SPF 级新西兰兔，6 只，雌雄各半，给药开始时动物体重：雄性2.7 ～ 3.2 kg、雌性2.7 ～ 2.9 kg，由中国食品药品检定研究院提供，实验动物质量合格证号：11400500005399。本实验均以科研为目的对新西兰兔进行养殖和使用，经北京昭衍新药研究中心股份有限公司动物管理与使用委员会（IACUC）批准（ACU14-472）。

1.3 主要试剂及仪器 2%兔红细胞混悬液由北京昭衍新药研究中心股份有限公司饲养检疫合格的健康兔全血经脱纤处理后获得；0.5%纤维蛋白原溶液（批号：20130307）、人凝血酶溶液（批号：20121105）、缺血小板血浆（批号：20120626）、脑磷脂混悬液（批号：20120618）由蓉生药业提供；半自动凝血仪（MC-4）购自德国美灵公司；气相色谱仪（Agilent 7890A）购自美国安捷伦公司；紫外分光光度计（TU-1800SPC）购自北京普析通用仪器有限责任公司。

1.4 异常毒性试验 根据《中国药典》三部（2010 版）要求进行异常毒性试验，试验方案设计见表1。

表1 PCC 异常毒性试验设计Tab.1 Design of abnormal toxicity test of PCC

1.5 体外溶血试验 以国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）发布的《治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则》和《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》为试验指导原则［1-2］，采用体外试管法，通过观察制品在体外是否引起兔红细胞溶血或凝聚，为临床研究提供体外试验资料。取洁净试管7支编号，1 ～ 5 号为供试品管，6 号为阴性对照管，7号为阳性对照管。向各试管依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠注射液、供试品溶液或灭菌注射用水，混匀后，置（37 ± 0.5）℃恒温箱温育。开始时每隔15 min 观察1 次，1 h 后，每隔1 h 观察1 次，观察3 h。如溶液呈透明红色，即表示溶血；如溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表示有红细胞凝聚作用。

1.6 刺激性试验 在参考CFDA 发布的《治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则》和《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》［1-2］基础上，取6 只新西兰兔，雌雄各半，采用同体左右侧自身对照法。于兔左耳耳缘静脉输注生理盐水（阴性对照），右耳耳缘静脉输注供试品溶液（供试品组），给药容量为1 mL／kg，给药速度为1 mL／min，每天给药1 次，连续给药7 d。试验期间，每天进行1 次临床观察和给药局部观察。末次药后3 d（D10），每组每性别前2 只动物实施安乐死，恢复期结束后（D21），对剩余动物实施安乐死，给药局部组织取材并进行组织病理学检查。

1.7 人凝血酶活性检查 按《中国药典》三部（2010版）人凝血酶活性检查（附录ⅨN）要求，取供试品溶液0.2 mL，人凝血酶溶液0.2 mL，0.9%氯化钠溶液0.2 mL，分别加入0.5%纤维蛋白原溶液0.2 mL，37 ℃放置24 h，观察有无凝块或蛋白析出。供试品做2 管，分别为供试样1 和2，放置期间至少观察2 次。

1.8 肝素含量 按《中国药典》三部（2010 版）肝素含量（附录ⅨP）要求，分别在样品杯中加入缺血小板血浆和脑磷脂混悬稀释液各100 μL，37 ℃放置1 min，加入供试品溶液0.1 mL，已预热至37 ℃的0.025 mol／L 氯化钙溶液0.1 mL，记录凝固时间。

1.9 活化的人凝血因子活性检查 按《中国药典》三部（2010 版）活化的凝血因子活性检查（附录ⅨO）要求，取缺血小板人血浆0.1 mL，加入脑磷脂混悬液0.1 mL，混匀，37 ℃放置1 min，加入供试品溶液［用Tris 缓冲液（pH 7.5）进行10 和100 倍稀释］0.1 mL、已预热至37 ℃的0.025 mol／L 氯化钙溶液0.1 mL，记录凝固时间。

1.10 磷酸三丁酯和聚山梨酯80 残留量检测 按《中国药典》三部（2010 版）方法进行检测，同时将本品与市售PCC 产品的指标进行比较。

2 结果

2.1 异常毒性试验

2.1.1 小鼠异常毒性试验 试验组小鼠腹腔注射供试品30 min 后，无异常反应。饲养观察期间，试验组和对照组小鼠全部健存，且无异常反应，观察期结束时，每只小鼠体重增加均> 50%。

2.1.2 豚鼠异常毒性试验 试验组豚鼠腹腔注射供试品30 min 后，无异常反应。饲养观察期间，试验组和对照组豚鼠全部健存，且无异常反应，观察期结束时，每只豚鼠体重增加均> 10%。

2.2 体外溶血试验 自放入恒温箱15 min 开始至3 h 观察结束，阴性对照管上层液体均无色澄明，管底红细胞下沉，经振摇后均匀分散；阳性对照管均可见溶液澄明红色，管底无红细胞残留；5 个供试品管上层液体均无色澄明，管底红细胞下沉，经振摇后均匀分散。

2.3 刺激性试验 试验期间，供试品组新西兰兔临床观察均未见异常反应。给药局部观察：供试品组部分新西兰兔自D2 给药后，给药局部开始陆续出现红斑、肿胀（自进针位置至针尖所在位置），最多有4／6 只动物出现给药局部红斑；D10 阴性对照和供试品组新西兰兔给药局部分别有0／5 和1／5 出现红斑，其余动物给药局部均未见异常；D11 ～ D21（恢复期）未见给药局部异常。给药局部大体解剖观察：D10 和D21 新西兰兔大体解剖观察未见异常改变。组织病理学检查：D10 和D21 新西兰兔给药局部组织病理学检查未见与供试品相关的炎性刺激改变。在本试验条件下，PCC 静脉输注（20 IU／mL，20 IU／kg，1 mL／min）给予新西兰兔，每天给药1次，连续给药7 d，给药局部未见与供试品相关的刺激性反应。

2.4 人凝血酶活性检查、肝素含量、活化的人凝血因子活性检查 3 项指标检测结果均符合《中国药典》三部（2010 版）质量要求，见表2。

表2 人凝血酶活性检查、肝素含量、活化的人凝血因子活性检查结果汇总Tab.2 Test results of human thrombin activity，heparin content and activated human coagulation factor activity

2.5 磷酸三丁酯和聚山梨酯80 残留量 2 项指标最终残留量均远低于《中国药典》三部（2010 版）对PCC 产品的要求（聚山梨酯80 ≤100，磷酸三丁酯≤10），同时也低于市售同类产品，见表3。

表3 磷酸三丁酯和聚山梨酯80 残留量的比较（μg／mL）Tab.3 Residual contents of tributyl phosphate and Tween 80（μg／mL）

3 讨论

引发血管溶血和刺激性的因素较多，包括生产工艺有无对杂蛋白的去除能力、药物自身的毒性、血浆渗透压的改变、各种微粒因素和医务人员操作不当等。除了非药物性因素外，应重点考察产品相关的引发血管溶血和刺激性的因素。PCC 是蓉生药业自主研发的冻干制剂，参考文献［3-4］，在制备工艺中采用离心法去除冷沉淀，并采用第2 步DEAE Sephadex A50 凝胶对可能引发溶血的杂蛋白进行去除。在配方选择上，借鉴国内外同类产品经验［5-9］，选择甘氨酸和盐酸赖氨酸为冻干和干热配方。按PCC 产品的最大输注量4000 IU（约200 mL，50 kg，80 IU／kg）计算，患者接受甘氨酸的最大剂量为0.08 g／kg，远低于甘氨酸LD50量。患者单次注射盐酸赖氨酸剂量为0.02 g／kg，远低于盐酸赖氨酸LD50量［10］。对制品中潜在的脂包膜和非脂包膜病毒采用2 步病毒灭活，也确保了患者临床用药的安全性。在采取上述措施情况下，进行的溶血刺激性试验表明，浓度为20 IU／mL 的PCC 在体外对兔红细胞无溶血作用，不引起红细胞凝聚，且多次静脉输注新西兰兔，对兔血管无刺激性作用。本实验结果与国内相关文献报告结果相符［11-12］。

聚山梨酯80 和磷酸三丁酯是S／D 病毒灭活剂，反应液中二者最终加量分别为10 和3 mg／mL，在病毒灭活后，大部分会经精制纯化步骤、再经超滤透析最终达到极低残留。根据《中国药典》三部（2010版）规定，PCC 制品中聚山梨酯80 和磷酸三丁酯残留量分别不得高于100 和10 μg／mL。患者在使用PCC 时的单次最大剂量约4000 IU（约200 mL，50 kg，80 IU／kg），即使按最大剂量输注，聚山梨酯80 输注量也不超过250 μg／kg，远低于文献报道中提到的阀值［13］，无毒性表现。磷酸三丁酯对小鼠的最低毒性剂量为10000 μg／kg，即使患者按最大剂量输注，也不过2000 μg／kg，远低于最低毒性剂量。此外，国外已进行了很多针对磷酸三丁酯和聚山梨酯80 的遗传毒性研究，未发现二者在体内或体外的遗传毒性影响［14-15］。本研究对连续3 批制品进行了异常毒性试验，结果表明，小鼠和豚鼠均正常生长，体重增加，对实验动物无毒性。

PCC 的早期临床使用中发现，患者使用后出现潜在血栓形成，包括出现弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）、浅表静脉血栓、深静脉血栓、肺水肿，以及一些连续接受大剂量的病例［>200 IU ／（kg·d）］中出现致死的心肌梗塞等。产生这种副作用的确切原因尚未完全阐明，可能是制剂中含有少量活化或部分活化的凝血因子［16-17］。非活化部分凝血活酶时间（non-activated partial thromboplastin time，NAPTT）试验和凝血酶纤维蛋白原凝血时间（thrombin fibrinogen clotting time，TFCT）试验是目前常用的体外评价PCC 潜在血栓性的方法。这两种方法简单、有效，被载入《欧洲药典》（10.0 版）和《中国药典》三部（2010 版）人凝血酶原复合物各论中。本实验严格控制生产工艺参数，选择合适的配方和保护剂避免制备过程中凝血因子的活化，结果表明，该2 项指标均符合质量要求，表明蓉生药业制备的PCC 在减少潜在血栓性方面的措施是成功的。

综上所述，蓉生药业生产的PCC 各项安全性指标均在控制范围内，可初步判定本制品具有临床安全性，且本制品已完成Ⅲ期临床试验，在临床试验过程中未发生任何与此相关的不良反应。