腺苷A2A受体拮抗剂通过PI3K途径抑制小鼠瘢痕增生的实验研究

张汝锋 肖虎

[摘要]目的：探究腺苷A2A受体（A2AR）拮抗剂SCH58261对小鼠瘢痕增生的影响，并进一步分析该影响作用与PI3K途径的相关性。方法：实验1：将32只BALB/c雄性小鼠随机分为4组（n=8）。各组均制备瘢痕增生模型，第5～14天時，对照组和模型组均用生理盐水局部注射、高低剂量组分别给2 mg/kg、5 mg/kg A2AR拮抗剂SCH58261局部注射，每日1次、连续10 d。实验2：将32只BALB/c雄性小鼠随机分为4组（n=8）。各组制备瘢痕增生模型，第5～14天，Ad-NC组局部注射Ad-NC及生理盐水，Ad-NC+模型组局部注射Ad-NC及生理盐水、Ad-NC+高剂量组局部注射Ad-NC及5 mg/kg SCH58261局部注射、Ad-PI3K+高剂量组局部注射Ad-PI3K及5 mg/kg SCH58261局部注射，每日1次，连续10 d。采用HE染色观察增生瘢痕的组织学特征，采用Western blot检测转化生长因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）、p-PI3K、p-AKT的表达水平。结果：实验1：模型组出现了典型的瘢痕增生，TGF-β1、Col-I、Col-III、p-PI3K、p-AKT的表达水平均高于对照组;低剂量组和高剂量组瘢痕增生明显改善，TGF-β1、Col-I、Col-III、p-PI3K、p-AKT的表达水平均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;实验2：过表达PI3K后，高剂量SCH58261改善瘢痕增生及抑制TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达的作用发生逆转（P<0.05）。结论：腺苷A2AR受体拮抗剂SCH58261能够抑制小鼠瘢痕增生，且这一作用与抑制PI3K途径有关。

[关键词]瘢痕增生;腺苷A2A受体;拮抗剂;PI3K途径;TGF-β1;胶原

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）04-0100-05

Experimental Study on Adenosine A2A Receptor Antagonist Inhibiting Scar Hyperplasia in Mice Through PI3K Pathway

ZHANG Rufeng，XIAO Hu

（Department of Burn and Wound Repair，Shandong Provincial Hospital，Jinan 250021，Shandong，China）

Abstract： Objective To investigate the effect of adenosine A2A receptor （A2AR） antagonist SCH58261 on scar hyperplasia in mice， and furtherly analyze the correlation between this effect and PI3K pathway. Methods Experiment 1： 32 BALB/C male mice were randomly divided into four groups （n=8）. The scar hyperplasia model was prepared in each group. At 5～14 d， the control group and the model group were injected with normal saline， and the high and low dose groups were injected with 2mg/kg and 5mg / kg A2AR antagonist SCH58261 respectively， once a day for 10 days. Experiment 2： 32 BALB/C male mice were randomly divided into four groups （n=8）. The scar hyperplasia model was prepared in each group. At 5～14d， Ad-NC group was injected with Ad-NC and normal saline， ad Ad-NC+model group was injected with Ad-NC and normal saline， ad Ad-NC+high dose group was injected with Ad-NC and 5 mg / kg SCH58261， Ad-PI3K + high dose group was injected with Ad-PI3K and 5mg/kg SCH58261， once a day for 10 days.Then HE staining was used to observe the histological characteristics of hypertrophic scars， and western blot was used to detect transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， type I collagen （Col-I）， type III collagen （Col-III）， p-PI3K， p- The expression level of AKT. Results Experiment 1： The model group had typical scar hyperplasia， the expression levels of TGF-β1， Col-I， Col-III， p-PI3K， and p-AKT were higher than those of the control group. scar hyperplasia was obvious in the low-dose and high-dose groups improved， the expression levels of TGF-β1， Col-I， Col-III， p-PI3K， and p-AKT were lower than the model group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Experiment 2： After overexpression of PI3K， high The effect of SCH58261 on improving scar hyperplasia and inhibiting the expression of TGF-β1， Col-I and Col-III was reversed （P<0.05）. Conclusion The adenosine A2AR receptor antagonist SCH58261 can inhibit scar hyperplasia in mice， and this effect is related to the inhibition of PI3K pathway.

Key words： scar hyperplasia; adenosine A2A receptor; antagonist; PI3K pathway; TGF-β1; collagen

瘢痕增生是创面修复的方式之一，以成纤维细胞异常增殖、细胞外基质尤其是胶原过度沉积为特征，形成瘢痕时不仅影响外观，还可引起疼痛、瘙痒等症状，严重时还会影响关节功能[1-3]。目前，瘢痕增生的机制尚未完全阐明，临床上也缺乏有效的防治手段。腺苷受体家族中的腺苷A2A受体（A2AR）与瘢痕增生的关系最为密切。国内肖虎的动物实验研究发现，敲除A2AR后瘢痕增生明显减轻、瘢痕内I型胶原减少[4-5];国外Perez-Aso M的细胞实验研究发现，A2AR激动剂通过激活PI3K途径增加成纤维细胞中胶原合成[6]。由此提出假设：A2AR可能通过PI3K途径参与瘢痕增生的形成。为了验证这一假设，本研究以瘢痕增生小鼠为实验对象，具体观察了腺苷A2A受体拮抗剂通过PI3K途径抑制小鼠瘢痕增生的作用及机制，旨在阐明瘢痕增生发病机制，并为防治瘢痕增生提供科学依据。

1  材料和方法

1.1 动物：8～10周龄的BALB/c雄性小鼠共64只、体质量18～20 g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可SCXK（沪）2018-0004。

1.2 试剂：A2AR拮抗剂SCH58261购自美国MCE公司;阴性对照腺病毒（Ad-NC）以及过表达PI3K的腺病毒（Ad-PI3K）购自上海吉凯公司;HE染色试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司;转化生长因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）、β-actin一抗购自美国Abcam公司;PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗购自美国CST公司。

1.3 仪器：正置显微镜购自日本Nikon公司;凝胶成像系统购自上海天能公司。

1.4 方法

1.4.1 动物分组、造模、干预

实验1：将32只实验动物分为对照组、模型组、低剂量组和高剂量组，每组各8只。参照肖虎[5]及林康[7]的研究进行假手术操作及瘢痕增生模型制备。对照组进行假手术操作，背部剃毛后做一长2 cm的切口，用6-0尼龙线缝合，第4天时拆除缝线并将固定拉伸机械装置固定在切口表面，但不进行拉伸，持续至第14天;后3组按照下列方法制备瘢痕增生模型：采用与对照组相同的方法制作切口、缝合并在第4天时拆除缝线、固定拉伸机械装置，拉伸切口至第14天。放置拉伸机械装置后次日开始进行干预，低剂量组和高剂量组分别给予2 mg/kg和5 mg/kg SCH58261局部注射，对照组和模型组给予等剂量生理盐水局部注射，每日1次，共10 d。分别在第7、10、14天时，对比各组的瘢痕生长状态，以评估SCH58261对瘢痕增生的抑制作用。

实验2：将32只实验动物分为Ad-NC组、Ad-NC+模型组、Ad-NC+高剂量组、Ad-PI3K+高剂量组，每组各8只。Ad-NC组采用对照组相同的方法进行假手术操作，第4～14天局部注射Ad-NC及生理盐水;后三组制备瘢痕增生模型，具体方法同上文所述后三组，在拉伸过程中，Ad-NC+模型组给予Ad-NC及生理盐水局部注射、Ad-NC+高剂量组给予Ad-NC及5 mg/kg SCH58261局部注射、Ad-PI3K+高剂量组给予Ad-PI3K及5 mg/kg SCH58261局部注射，每日1次，共10 d。以此实验来验证PI3K在SCH58261抑制瘢痕增生中的作用。

第14天时处死实验1和实验2中的64只动物、分离增生瘢痕组织并分为两份，一份用4%多聚甲醛固定并进行石蜡包埋，另一份用液氮冷冻并在-80℃低温冰箱中保存。

1.4.2 HE染色：取石蜡包埋的增生瘢痕组织，制备病理切片后采用HE染色试剂盒进行染色，按照试剂盒说明性进行操作，在显微镜下观察增生瘢痕的组织学特征，按照瘢痕厚度/周围正常皮肤组织厚度计算瘢痕抬高指数。

1.4.3 Western Blot檢测：取液氮冷冻的增生瘢痕组织，加入RIPA裂解液后匀浆提取蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白含量，取30 μg蛋白进行Western Blot检测。在SDS-聚丙烯酰胺中电泳分离不同分子量的蛋白后电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1 h，1：1 000稀释的TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗或1：3 000稀释的β-actin一抗4℃孵育过夜，洗膜3次后室温孵育1：2 000稀释的二抗1 h，最后在凝胶成像系统内显影得到蛋白条带及灰度值，计算TGF-β1/β-actin、Col-Ⅰ/β-actin、Col-Ⅲ/β-actin、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的灰度值比值作为蛋白相对表达水平。

1.5 统计学分析：采用SPSS 21.0软件录入数据，计量资料经正态性检验符合正态分布并采用均数±标准差表示，多组间的比较采用方差分析、两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 实验1中4组瘢痕生长状态对比：造模过程中，对照组创面逐渐愈合，未见明显瘢痕增生;模型组的愈合创面内可见明显瘢痕增生、隆起;低剂量组和高剂量组的瘢痕增生较模型组明显改善。见图1。

2.2 实验1中4组瘢痕组织学特征及瘢痕抬高指数比较：对照组皮肤组织中细胞形态正常、胶原纤维排列整齐;模型组增生瘢痕中可见大量成纤维细胞、胶原纤维及新生血管，排列混乱、部分呈结节状或旋涡状，还可见炎症细胞浸润，整体瘢痕组织学特征以及瘢痕抬高指数与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;低、高剂量组增生瘢痕组织学特征较模型组明显改善，瘢痕抬高指数较模型组降低，且高剂量组整体改善效果较低剂量组更明显，瘢痕抬高指数也较低剂量组更低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2～3。

2.3 实验1中4组增生瘢痕中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达水平比较：与对照组比较，模型组增生瘢痕组织中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，低剂量组、高剂量组增生瘢痕组织中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达水平明显降低，且高剂量组降低更明显，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4、表1。

2.4 实验1中4组增生瘢痕中p-PI3K、p-AKT表达水平的比较：与对照组比较，模型组增生瘢痕组织中p-PI3K、p-AKT的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，低剂量组、高剂量组增生瘢痕组织中p-PI3K、p-AKT的表达水平明显降低，且高剂量组降低更明显，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5、表2。

2.5 实验2中4组增生瘢痕中p-PI3K、p-AKT表达水平的比较：与Ad-NC组比较，Ad-NC+模型组增生瘢痕组织中p-PI3K、p-AKT的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）;与Ad-NC+模型组比较，Ad-NC+高剂量组增生瘢痕组织中p-PI3K、p-AKT的表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与Ad-NC+高剂量组比较，Ad-PI3K+高剂量组增生瘢痕组织中p-PI3K、p-AKT的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图6、表3。

2.6 实验2中4组小鼠增生瘢痕组织学特征及抬高指数的比较：Ad-NC组皮肤组织中细胞形态正常、胶原纤维排列整齐，Ad-NC+模型组出现了瘢痕增生的组织学改变，瘢痕增生指数较Ad-NC组增加，差异有统计学意义（P<0.05）;Ad-NC+高剂量组瘢痕增生的组织学特征较模型组明显改善，瘢痕增生指数较Ad-NC+模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）;Ad-PI3K+高剂量组瘢痕增生的组织学特征较Ad-NC+高剂量组加重，瘢痕增生指数较Ad-NC+高剂量组增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图7～8。

2.7 实验2中4组增生瘢痕中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达水平的比较：与Ad-NC组比较，Ad-NC+模型组增生瘢痕组织中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）;Ad-NC+高剂量组增生瘢痕组织中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与Ad-NC+高剂量组比较，Ad-PI3K+高剂量组增生瘢痕组织中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图9、表4。

3  讨论

组织再生和瘢痕增生是两种常见的创面修复方式，其中瘢痕增生是成纤维细胞异常增殖、胶原蛋白过度沉积的病理修复状态。在正常的组织修复过程中，创面内纤维母细胞聚集并形成早期纤维组织，有利于组织的再生及修复。但是，创面较大或创面组织再生能力较弱时，纤维母细胞会大量转化为成纤维细胞，产生大量TGF-β1并刺激Col-Ⅰ、Col-Ⅲ不断合成，最终在创面局部形成瘢痕增生[8-10]。瘢痕增生会对创面局部的外观及相应的肢体功能产生不利影响，需要进行积极防治。

目前，瘢痕增生的发病机制尚不十分清楚，多项研究认为成纤维细胞异常增殖引起细胞外基质过度堆积与瘢痕增生密切相关[11-12]。因此，近些年越来越多学者开始关注成纤维细胞活化及增殖的调控机制。Perez-Aso M[6]的细胞实验发现，A2AR激动剂能够促进成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成，表明A2AR介导的成纤维细胞活化和增殖可能在瘢痕增生中起重要作用。国内两项A2AR与瘢痕增生相关的动物实验发现，敲除A2AR后小鼠瘢痕增生减轻且胶原合成减少[4-5]。本研究以小鼠为实验对象、参照肖虎[5]及林康[7]的研究制备瘢痕增生模型，模型组肉眼观察出现了瘢痕增生且HE染色观察到瘢痕增生组织中存在大量成纤维细胞、胶原纤维及新生血管，符合瘢痕增生的病理特征。在此基础上将A2AR拮抗剂SCH58261用于瘢痕增生的治疗，经瘢痕的大体观察及组织学观察发现：SCH58261干预后小鼠的瘢痕增生明显改善，与既往研究[4-5]发现A2AR敲除改善瘢痕增生的結果一致，表明A2AR拮抗剂SCH58261对瘢痕增生具有抑制作用。

在瘢痕增生过程中，TGF-β1是促进成纤维细胞活化和增殖的关键细胞因子，成纤维细胞能够合成Col-Ⅰ、Col-Ⅲ并在局部堆积形成瘢痕[13-15]。既往其他学者的研究及本研究均发现，增生瘢痕中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达增加。A2AR相关的细胞实验和动物实验已经发现，A2AR在TGF-β1介导组织纤维化的过程中起促进作用[5，16-17]，同时也对Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的合成具有促进作用[4，6]。本研究在使用A2AR拮抗剂SCH58261干预后，增生瘢痕中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达明显减少，表明抑制A2AR能够减少TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达，与本研究已观察到A2AR拮抗剂抑制瘢痕增生的结果吻合，也与既往研究[4-6，15-16]关于A2AR调控TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达的结果一致。

A2AR是腺苷的受体之一，激活后通过下游PI3K[6]、ERK[18]、p38[19]等信号通路发挥生物学作用。根据Perez-Aso M的研究，A2AR激活后通过PI3K途径增加胶原合成，但是对Smad2/3、ERK等通路无明显影响。基于此，本研究进一步验证了PI3K途径在A2AR拮抗剂SCH58261抑制瘢痕增生中的作用，通过局部注射腺病毒的方式增加PI3K表达、逆转SCH58261抑制PI3K途径的作用。在过表达PI3K后，Ad-PI3K+高剂量组增生瘢痕中p-PI3K、p-AKT的表达均明显高于Ad-NC+高剂量组，表明腺病毒注射实现了PI3K的过表达及PI3K途径的激活。同时本研究还观察到：Ad-PI3K+高剂量组瘢痕增生较Ad-NC+高剂量组加重，TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达也明显增加，表明过表达PI3K使高剂量SCH58261抑制瘢痕增生的作用发生逆转，进而提示SCH58261抑制瘢痕增生的作用与抑制PI3K途径有关。

综上所述，本研究的实验结果提示A2AR拮抗剂SCH58261能够抑制小鼠瘢痕增生且这一作用与抑制PI3K途径有关，这为今后深入探究瘢痕增生的发病机制提供了依据，也为防治瘢痕增生提供了新思路，未来A2AR拮抗剂SCH58261可作为防治瘢痕增生的药物、但这仍需更多的实验来进行探究。

[参考文献]

[1] Zhang D Z，Liu F，Xiao W L，et al.Longitudinal study of scar hyperplasia formation following cleft lip wound healing[J].J Craniofac Surg，2018，29（2）：e211-e215.

[2]Gao H，Wang W，Geng Y，et al.Clinical experience in emergency management of severe facial trauma[J].J Craniofac Surg，2020，31（2）：121-123.

[3]徐晨，郭芳芳.增生性瘢痕治疗的研究进展[J].东南大学学报（医学版），2019，38（1）：195-198.

[4]肖虎，李少华，王德昌，等.腺苷A2A受体基因敲除小鼠瘢痕胶原亚型的变化[J].中国组织工程研究，2012，16（2）：231-234.

[5]肖虎，冉丽，禚莹莹，等.腺苷A2A受体基因敲除小鼠瘢痕增生中TGF-β的表达及意义[J].中华整形外科杂志，2010，26（2）：136-138.

[6]Perez-Aso M，Fernandez P，Mediero A，et al.Adenosine 2A receptor promotes collagen production by human fibroblasts via pathways involving cyclic AMP and AKT but independent of Smad2/3[J].FASEB J，2014，28（2）：802-812.

[7]林康，蘇海燕，虞庆，等.苏拉明通过抑制纤维增生和炎症反应减轻小鼠的瘢痕增生[J].中国病理生理杂志，2019，35（11）：2070-2077.

[8]Li Q，Qin Z，Nie F，et al.Metabolic reprogramming in keloid fibroblasts：Aerobic glycolysis and a novel therapeutic strategy[J].Biochem Biophys Res Commun，2018，496（2）：641-647.

[9]Jin J，Zhai H F，Jia Z H，et al.Long non-coding RNA HOXA11-AS induces type I collagen synthesis to stimulate keloid formation via sponging miR-124-3p and activation of Smad5 signaling[J].Am J Physiol Cell Physiol，2019，317（5）：1001-1010.

[10]林简，刘晓红，王荣坤，等.瘢痕疙瘩中微小RNA-34b的表达及与转化生长因子-β1的相关性[J].中国美容医学，2020，29（7）：93-96.

[11]Chawla S，Ghosh S.Regulation of fibrotic changes by the synergistic effects of cytokines，dimensionality and matrix：towards the development of an in vitro human dermal hypertrophic scar  model[J].Acta Biomater，2018，69：131-145.

[12]Lingzhi Z，Meirong L，Xiaobing F.Biological approaches for hypertrophic scars[J].Int Wound J，2020，17（2）：405-418.

[13]Wei G，Xu Q，Liu L，et al.LY2109761 reduces TGF-β1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar fibroblasts[J].Arch Dermatol Res，2018，310（8）：615-623.

[14]Sun G F，Li H C，Zhan Y P，et al.SnoN residue（1-366）attenuates hypertrophic scars through resistance to transforming growth factor-β1-induced degradation[J].Lab Invest，2019，99（12）：1861-1873.

[15]Huang Y，Wang Y，Wang X，et al.The effects of the transforming growth factor-β1（TGF-β1）signaling pathway on cell proliferation and cell migration are mediated by ubiquitin specific protease 4（USP4） in hypertrophic scar tissue and primary fibroblast cultures[J].Med Sci Monit，2020，20（26）：e920736.

[16]Crain S K，Robinson S R，Thane K E，et al.Extracellular vesicles from wharton's jelly mesenchymal stem cells suppress CD4 expressing T cells through transforming growth factor beta and adenosine signaling in a canine model[J].Stem Cells Dev，2019，28（3）：212-226.

[17]Mateus M，Ilg M M，Stebbeds W J，et al.Understanding the role of adenosine receptors in the myofibroblast transformation in peyronie's disease[J].J Sex Med，2018，15（7）：947-957.

[18]El-Shamarka M E A，Kozman M R，Messiha B A S.The protective effect of inosine against rotenone-induced Parkinson's disease in mice; role of oxido-nitrosative stress，ERK phosphorylation，and A2AR expression[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2020，393（6）： 1041-1053.

[19]Ren H，Guo X，Wang X，et al.Adenosine A2A receptor deficiency prevents p38MAPK activation and apoptosis of mouse hippocampal cells in the chronic hypoxic-hypercapnia model[J].Biosci Biotechnol Biochem，2019，83（10）：1837-1842.

[收稿日期]2020-09-07

本文引用格式：張汝锋，肖虎.腺苷A2A受体拮抗剂通过PI3K途径抑制小鼠瘢痕增生的实验研究[J].中国美容医学，2022，31（4）：100-105.