构建基于铁死亡相关长链非编码RNA的胆管癌预后模型

张 琳，石张镇，白元松

(吉林大学中日联谊医院 血液肿瘤科，吉林 长春130033)

胆管癌(CCA)是一种侵袭性胆道上皮细胞恶性肿瘤，占原发肝癌的10%-15%[1]。目前，手术仍是首选治疗CCA的方法[2]，然而由于缺乏典型的临床症状，很难在早期诊断CCA，因此只有30%-40%的患者适合手术治疗，且术后复发的概率较高[3]。铁死亡是一种依赖铁的调节性细胞死亡形式，由脂质过氧化过度引起，与多种肿瘤的发生和治疗反应有关[4]。近年来，越来越多的证据表明铁死亡具有抑制肿瘤的作用，可用于肿瘤的治疗[5]。长链非编码RNA(lncRNAs)是非蛋白质编码的转录产物，参与多种复杂的生物过程[6]，lncRNAs在不同类型肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[7]。本研究旨在利用公共数据库中CCA的表达数据筛选出与铁死亡基因相关的lncRNAs，然后基于这些lncRNAs构建CCA的预后生存模型。

1 材料与方法

1.1 获取数据集

从TCGA 数据库(https://gdc.nci.nih.gov/) 中下载 45 例胆管癌的基因表达数据和生存数据，基因表达数据与GENCODE数据库资料(https://www.gencodegenes.org/hu-man/,gencode.v22)匹配添加注释信息。从FerDb数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb/)中获得259个铁死亡相关基因[8]。

1.2 筛选铁死亡相关的lncRNAs

用“limma”R包识别肿瘤组织与正常组织间差异表达的lncRNAs。通过Pearson 相关性分析计算识别出与铁死亡基因表达量相关的差异 lncRNAs。

1.3 构建预后模型

1.4 基因功能富集分析

用“limma”R包获得正常组织与肿瘤组织中差异表达基因，选择与多因素COX分析筛选出的关键的影响预后的铁死亡相关差异lncRNAs共表达的差异基因。用“clusterProfiler”R包对这些差异基因进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，研究这些基因所具有的生物学功能。

1.5 统计分析

所有的统计分析在R语言(4.0.4版本)中利用相关的R包进行，认为P<0.05 为有统计学差异。

2 结果

2.1 数据处理及预后模型的构建

经秩和检验及Pearson相关性分析获得537个铁死亡相关差异lncRNAs。通过单因素COX分析及多因素COX分析获得3个用于构建预后模型的关键的铁死亡相关差异lncRNAs，并得到风险评分公式：RS=3.93X LINC01714表达量+4.90X LINC02997表达量+-0.77X LINC01621表达量。用风险评分公式计算每个患者的得分，将高于中位得分的患者归为高风险组，反之为低风险组。生存分析(K-M曲线)结果表明高风险组总存活率显著低于低风险组(P=0.0012)(图1)。ROC曲线得到1年，3年及5年的AUC分别为0.81、0.81及0.82，说明模型能够较好的预测患者的预后(图2)。

图1 K-M曲线显示高风险组和低风险组的患者预后

图2 1年，3年和5年的ROC曲线

2.2 基因功能富集分析

在筛选出的312个与关键lncRNAs共表达的蛋白编码差异基因中，功能富集分析显示这些差异基因主要富集在酶抑制剂活性、脂质转运体活性及铁离子结合等。通路主要富集在胆汁分泌、化学致癌受体活化、PPAR信号通路及药物代谢等。

3 讨论

胆管癌具有很高的侵袭性，中位生存期小于24个月，是一种难治性预后差的恶性肿瘤。近年来，许多研究探索新的生物标志物和基因标记来预测胆管癌的预后[9-12]，也有部分研究通过铁死亡相关lncRNAs构建模型来预测癌症患者的预后[13-17]。提示铁死亡相关的lncRNAs在调控肿瘤细胞中发挥关键作用。然而，在胆管癌中尚未发现用铁死亡相关的lncRNAs评价预后的研究。本研究利用TCGA数据库筛选了在肿瘤组织和正常组中差异表达的lncRNAs，用相关性分析获得了铁死亡相关的差异lncRNAs，经过单因素COX分析和多因素COX分析获得了由“LINC01714”,“LINC02997”,“LINC01621”构建的预后模型，该模型可将CCA患者分为高风险组和低风险组，随后用生存分析和ROC曲线证实了模型有良好的效能。在筛选的3个关键lncRNAs中，Li H等人通过体外和体内实验证实LINC01714在CCA的发生发展中有重要意义[18]。研究表明，LINC01714与FOXO3蛋白相互作用，抑制其在CCA细胞中的磷酸化水平。这也为我们的研究结果提供了佐证，提示LINC01714可作为CCA患者治疗的候选药物。目前，尚没有关于其余2个lncRNAs在肿瘤中的研究，对于本研究中新发现的这两个预后lncRNAs标志物，尚需临床和实验的进一步研究探求其功能和机制。

本研究存在几个局限性：首先，由于CCA的低发病率，从公共数据库获得的样本较小。其次，研究结果没有通过进一步的实验验证进一步阐明潜在的机制。尽管如此，本研究仍为胆管癌的个体化治疗提供了有潜力的生物标志物，为胆管癌的预后和治疗提供了新线索。