circRNA_0128846 靶向miR-1183 介导人非小细胞肺癌细胞放射抵抗的研究

陆滢 邓鑫州 宋仕茂 骆志国

湖北医药学院附属太和医院肿瘤防治中心，十堰 442099

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重影响人类健康[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%[2]。放疗是其主要的非手术治疗方法，但放射抵抗往往会导致局部肿瘤复发和预后不良[3-4]，目前尚无逆转NSCLC放射抵抗的有效靶点，亟需探究。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类在真核生物中广泛表达的环状非编码RNA，其由mRNA 前体通过反向剪接产生。不同于其他线性非编码RNA，circRNA 不具备5′端帽和3′端尾结构，对核酸外切酶具有抵抗性，故circRNA 极具稳定性[5-6]。2011 年，Salmena 等[7]提出，circRNA 具有微小RNA（microRNA，miRNA）反应元件，可作为竞争性内源性RNA 海绵吸附并抑制miRNA，从而改变细胞的基因表达。circRNA 还可以通过结合RNA 结合蛋白、调节基因转录等方式来发挥作用，故其可参与基因转录、转录后调控、细胞内RNA调控网络及蛋白质翻译等生理过程，进而影响细胞周期进程、细胞衰老和凋亡等多种生物学过程[8]。

研究结果证实，circRNA 在肺癌、胃癌、膀胱癌和乳腺癌等多种肿瘤中表达异常，其参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等多种生物学过程，因此circRNA 被认为是一种潜在的肿瘤生物标志物及治疗靶点[9]。Wang 等[10]发现，circRNA_0008305可诱导NSCLC 细胞发生上皮间充质转化，进而促进肺癌转移。circRNA_0000199 通过抑制miR-198上调磷脂酰肌醇-3 激酶调节亚基1，以此增强胃癌细胞对铂类药物的耐药性[11]。另有研究结果证实，circRNA 可能参与肿瘤的放射抵抗过程[12]。Ma 等[13]发现，circRNA_0122683 在食管癌组织中高表达，其通过调控miR-186-5p/腺苷二磷酸核糖聚合酶9（PARP9）轴调控细胞恶性程度并促进放射抵抗。circRNA_100367 通过吸附miR-217 增强食管癌细胞的放射抗性[14]。目前，针对circRNA 与NSCLC细胞放射敏感性关系的研究尚不多见，circRNA_0128846 对NSCLC 细胞放射敏感性的影响不清楚。本研究探讨circRNA_0128846 对人NSCLC 细胞放射敏感性的调控作用及分子机制，以期为解决临床NSCLC 放射抵抗问题提供潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

人支气管上皮细胞Beas-2B、人NSCLC 细胞A549、H460、H1299、H1975 和人胚肾细胞293T均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养代次为10。DMEM 培养基、DMEM/F12培养基、DMEM 高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）、0.25%胰蛋白酶、表皮细胞生长因子、β-成纤维细胞生长因子、2% B27 添加物均购自美国Gibco 公司；青霉素和链霉素均购自浙江吉诺生物医药技术有限公司；Lipofectamine3000、Trizol 试剂均购自美国Invitrogen 公司；SYBR Green PCR 试剂盒购自日本Takara 公司；RIPA 裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司；CCK-8 试剂盒、RNA 反转录试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；miR-1183 抑制剂、miR-1183 模拟物及阴性对照均购自苏州吉玛基因股份有限公司。NanoDrop2000 分光光度计、酶联免疫分析仪均购自美国Thermo 公司；X-RAD 320 直线加速器购自美国North Branford 公司。质粒（LUC）购自上海和元生物技术股份有限公司；引物购自广州生工生物工程股份有限公司。双荧光素酶报告基因分析系统购自美国Promega 公司。

1.2 细胞培养及照射

人支气管上皮细胞Beas-2B 和人NSCLC 细胞A549、H460、H1299、H1975 分别培养于含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 g/ml 链霉素的DMEM 培养基中；人胚肾细胞293T 培养于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基中，培养条件均为37℃、5% CO2。放射抵抗细胞系是本实验室前期经分割辐射（2 Gy×30 次）诱导而成的，已建立具有稳定放射抵抗能力的人NSCLC 细胞A549（命名为A549R），并每2 周给予低剂量（2 Gy）照射以维持细胞的辐射抗性，照射条件为6 MV X 射线，剂量率为4 Gy/min。

1.3 目标circRNA、miRNA 的筛选

在GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下载微阵列数据集GSE101684，筛选出在4 对癌组织与癌旁正常组织中差异表达最显著的10 种circRNA[筛选标准为log2FC（折叠变化）≥1.5，且P＜0.05]，选择在亲本细胞和放射抵抗细胞中表达差异最显著的circRNA 作为目标circRNA。利用人类环状RNA 数据库（http://www.circbank.cn）和circinteractome 数据库（https://circinteractome.nia.nih.gov）预测目标circRNA 下游的miRNA，筛选出沉默目标circRNA 后，表达水平上升最显著的miRNA作为目标miRNA。

1.4 细胞转染

将人NSCLC 细胞A549、A549R 接种于6 孔培养板中（1×105个/孔），培养至50%～70%融合度后转染，转染操作按照Lipofectamine3000 说明书进行。对A549R 细胞进行转染，目标circRNA 沉默载体为pLKD-CMV-G＆PR-U6-shRNA，干扰序列为5′-TCCAAGCTGGCCAGCAGCCAGC-3′；对A549细胞进行转染，目标circRNA 过表达载体为pIREShrGFP-1a，目标circRNA 过表达序列见“http://www.circbank.cn/search.html?selectValue=has_circ_01288 46”。使用miRNA 抑制剂转染A549 细胞以实现miRNA 沉默；使用miRNA 模拟物转染A549R 细胞以实现miRNA 过表达，转染对照组均为空载体。

1.5 细胞克隆形成实验

将转染后24 h 的人NSCLC 细胞A549、A549R各分为3 组进行照射，照射剂量分别为0、4、8 Gy，照射后将细胞接种于6 孔低吸附培养板中（1×104个/孔），使用DMEM/F12 无血清培养基培养，培养基中加入50 ng/ml 表皮细胞生长因子、10 ng/ml β-成纤维细胞生长因子和2% B27 添加物。培养7 d 后在显微镜下拍照分析，以细胞克隆最大径＞20 μm为判定标准，统计细胞克隆形成率（细胞克隆形成率=细胞克隆数/细胞总数×100%）[15]。

1.6 荧光实时定量（ fluorescence real-time quantitative，qRT）PCR

使用Trizol 试剂从细胞中提取总RNA，使用NanoDrop2000 分光光度计检测纯化的总RNA 的质量和浓度。按照RNA 反转录试剂盒说明书提取RNA，并进行反转录合成互补DNA（cDNA）。采用SYBR Green PCR 试剂盒检测细胞中在人NSCLC癌组织与配对的癌旁正常组织中差异表达的10 种circRNA 以及可能与目标circRNA 结合的miRNA的表达水平，操作按照说明书进行。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）作为目标circRNA 的参考基因，U6 作为目标miRNA 的参考miRNA。PCR 反应条件：94℃预变性1 min，94℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 个循环。引物序列如表1 所示。

表1 荧光实时定量聚合酶链反应的引物序列Table 1 Primers sequences used in fluorescence real-time quantitative polymerase chain reaction

1.7 双荧光素酶报告基因的分析

质粒在荧光素酶基因启动子（LUC-目标circRNA）下游插入序列5′-CUUACAGUAC-3′（目标circRNA 中miRNA 的潜在结合序列）。将293T细胞接种于24 孔培养板中（5×104个/孔），将LUC-目标circRNA 与miRNA 模拟物或miRNA 阴性对照共转染293T 细胞，48 h 后裂解细胞，使用双荧光素酶报告基因分析系统测定荧光素酶活性。

1.8 统计学分析

应用SPSS 23.0 软件、GraphPad Prism 7.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，2 组间数据的比较采用独立样本t检验（方差齐）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circRNA_0128846 高表达对人NSCLC 细胞放射抵抗的影响

由图1A 可见，经GEO 数据库微阵列数据集GSE101684（包括4 对癌组织与配对的癌旁正常组织）筛选，在人NSCLC 癌组织中表达上调的前10 种circRNA 分别为circRNA_0116061、circRNA_0116961、circRNA_0106711、circRNA_0106714、circRNA_0128846、circRNA_0094088、circRNA_0046264、circRNA_0096041、circRNA_0096042 和circRNA_0096049。qRT-PCR 结果显示，上述10 种circRNA 中，circRNA_0116961、circRNA_0106714、circRNA_0128846 和circRNA_0046264 在A549R 细胞中的相对表达水平均高于A549 细胞（均P＜0.05），其中circRNA_0128846表达差异最显著（图1B）。故本研究选择circRNA_0128846 作为目标circRNA。qRT-PCR 检测circRNA_0128846 在正常人支气管上皮细胞Beas-2B 以及人NSCLC细胞A549、H460、H1299、H1975中的相对表达水平，结果显示，circRNA_0128846 在A549、H460、H1299、H1975 细胞中的相对表达水平均高于Beas-2B 细胞（均P＜0.01，图1C）。以上4 株人NSCLC细胞的克隆形成实验结果显示，经0、4、8 Gy 的X 射线照射后，随着circRNA_0128846 表达水平的升高，4 株人NSCLC 细胞的克隆形成能力逐渐增强（图2），这提示circRNA_0128846 的高表达可能与人NSCLC 细胞的放射抵抗呈正相关。

图1 筛选目标circRNA 并检测其在正常人支气管上皮细胞Beas-2B 及人非小细胞肺癌细胞A549、H460、H1299、H1975 中的表达情况 A 为以log2FC(折叠变化)≥1.5，且P＜0.05 为筛选标准，经GEO 数据库微阵列数据集GSE101684 筛选在4 对人NSCLC 癌组织与配对的癌旁正常组织中差异表达的circRNA 的热图，红色、蓝色条带分别表示高表达、低表达；B 为qRT-PCR 检测A549 细胞及其放射抵抗细胞（A549R）中10 种circRNA 的相对表达水平；C 为circRNA_0128846 的相对表达水平。a 表示与A549 细胞相比，差异均有统计学意义（t=3.592、2.972、10.000、2.997，P=0.023、0.041、0.001、0.040）；b 表示与Beas-2B 细胞相比，差异均有统计学意义（t=6.200、7.903、6.010、6.132，P=0.003、0.001、0.004、0.004）。circRNA 为环状RNA；qRT-PCR 为荧光实时定量聚合酶链反应Figure 1 Screening target circRNA and detecting its expression in normal human bronchial epithelial cell Beas-2B and human non-small cell lung cancer cell A549, H460, H1299, H1975

图2 不同剂量X 射线照射后正常人支气管上皮细胞Beas-2B 和人非小细胞肺癌细胞A549、H460、H1299、H1975 的克隆形成情况（×200）Figure 2 Clone formation in normal human bronchial epithelial cells Beas-2B and human non-small cell lung cancer cell A549, H460, H1299,H1975 after irradiation with different doses of X-ray radiation (×200)

2.2 circRNA_0128846 对人NSCLC细胞放射抵抗的影响

细胞克隆形成实验结果显示，在4、8 Gy X 射线的照射下，A549R细胞的辐射抗性显著高于亲本A549细胞（均P＜0.05，图3）。qRT-PCR检测结果表明，在A549 细胞中成功过表达了circRNA_0128846（图4A），与对照组相比，过表达circRNA_0128846 显著增强了A549细胞的克隆形成能力（0.22%对0.45%，图4B）；在A549R 细胞中成功沉默了circRNA_0128846（图5A），与对照组相比，沉默circRNA_0128846 显著降低了A549R 细胞的克隆形成能力（0.23%对0.10%，图5B），该结果提示circRNA_0128846 能够促进人NSCLC 细胞的放射抵抗。

图3 不同剂量X 射线照射后人非小细胞肺癌细胞A549 及其放射抵抗细胞（A549R）的克隆形成情况（×200） a 表示与A549 细胞相比，差异均有统计学意义（t=4.427、3.479，P=0.011、0.025）Figure 3 Clone formation in human non-small cell lung cancer cell A549 and its radioresistant cell A549R after irradiation with different doses of X-ray radiation (×200)

图4 circRNA_0128846 过表达载体转染人非小细胞肺癌细胞A549 48 h 后的相对表达水平（A）及8 Gy X 射线照射后的克隆形成能力（B，×200） a 表示与空载体相比，差异均有统计学意义（t=4.022、4.427，P=0.016、0.011）。 circRNA 为环状RNAFigure 4 Relative expression level of circRNA_0128846 overexpression vector transfected human non-small cell lung cancer cell A549 for 48 h (A) and clone formation ability after 8 Gy X-ray irradiation (B, ×200)

图5 circRNA_0128846 沉默载体转染人非小细胞肺癌细胞A549 的放射抵抗细胞（A549R） 48 h 后的相对表达水平（A）及8 Gy X 射线照射后的克隆形成能力（B，×200） a 表示与空载体相比，差异均有统计学意义（t=6.002、3.780，P=0.004、0.019）。 circRNA 为环状RNAFigure 5 Relative expression level of circRNA_0128846 silencing vector transfected the radioresistant cell (A549R) of human non-small cell lung cancer cell A549 for 48 h (A) and clone formation ability after 8 Gy X-ray irradiation (B, ×200)

2.3 与circRNA_0128846 结 合 的miRNA

在circinteractome 数据库和人类环状RNA 数据库中取交集得到9 种可能与circRNA_0128846 结合的潜在miRNA。qRT-PCR 检测A549R 细胞中circRNA_0128846 沉默后各miRNA 的表达，结果显示，沉默circRNA_0128846 可上调miR-1183 和miR-1827 的表达（t=5.095、3.464，P=0.007、0.026），其中miR-1183 表达上调最显著，该结果提示circRNA_0128846 可能与miR-1183 结合，并下调其表达。采用生物信息学预测circRNA_0128846 与miR-1183 潜在的结合位点如图6 所示。qRT-PCR 检测结果表明，在A549细胞中过表达circRNA_0128846 可显著下调miR-1183 的表达（t=6.002，P=0.004）。在人胚肾293T细胞中进行双荧光素酶报告基因分析的结果显示，过表达miR-1183 可显著降低circRNA_0128846 的表达（t=4.562，P=0.010），这提示miR-1183 可以与circRNA_0128846 结合并下调其表达。经qRTPCR 验证，miR-1183 在A549R 细胞中的表达水平显著低于A549 细胞（t=6.025，P=0.004），这提示miR-1183 可能与人NSCLC 细胞的放射抵抗有关。

图6 生物信息学预测circRNA_0128846 与miR-1183 的结合位点 circRNA 为环状RNA；miR 为微小RNAFigure 6 Bioinformatics prediction of the binding site of circRNA_0128846 and miR-1183

2.4 circRNA_0128846 靶向miR-1183 的放射抵抗

经qRT-PCR 验证，使用miR-1183 抑制剂成功对A549 细胞进行了miR-1183 沉默，沉默miR-1183 显著增强了8 Gy X 射线照射后A549 细胞的克隆形成能力（0.21%对0.31%，图7）；同时，使用miR-1183 模拟物成功对A549R 细胞进行了miR-1183 过表达，过表达miR-1183 显著降低了8 Gy X射线照射后A549R 细胞的克隆形成能力（0.26%对0.15%，图8），这提示miR-1183 可抑制人NSCLC细胞的放射抵抗。过表达circRNA_0128846 可显著增强8 Gy X 射线照射后A549 细胞的克隆形成能力（P＜0.01），而过表达miR-1183 逆转了circRNA_0128846 诱导的放射抵抗（1.90%对1.20%，图9），这表明circRNA_0128846 可以通过介导miR-1183促进人NSCLC 细胞的放射抵抗。

图7 miR-1183 抑制剂转染人非小细胞肺癌细胞A549 48 h 后的相对表达水平（A）及8 Gy X 射线照射后的克隆形成能力（B，×200）a 表示与空载体相比，差异均有统计学意义（t=4.848、3.293，P=0.008、0.030）。miR 为微小RNAFigure 7 Relative expression level of miR-1183 inhibitor transfected human non-small cell lung cancer cell A549 for 48 h (A) and clone formation ability after 8 Gy X-ray irradiation (B, ×200)

图8 miR-1183 模拟物转染人非小细胞肺癌细胞A549 的放射抵抗细胞（A549R） 48 h 后的相对表达水平（A）及8 Gy X 射线照射后的克隆形成能力（B，×200） a 表示与空载体相比，差异均有统计学意义（t=9.219、3.671，P=0.001、0.021）。 miR 为微小RNAFigure 8 Relative expression level of miR-1183 mimic transfected the radioresistant cell (A549R) of human non-small cell lung cancer cell A549 for 48 h (A) and clone formation ability after 8 Gy X-ray irradiation (B, ×200)

图9 人非小细胞肺癌细胞A549 过表达circRNA_0128846 和miR-1183 后的克隆形成能力（×200） a 表示与circRNA_0128846 空载体相比，差异有统计学意义（t=7.000，P=0.002）；b 表示与circRNA_0128846 过表达载体+miR-1183 空载体相比，差异有统计学意义（t=6.325，P=0.003）。circRNA 为环状RNA； miR 为微小RNAFigure 9 Clonal formation ability of human non-small cell lung cancer cell A549 after overexpression of circRNA_0128846 and miR-1183(×200)

3 讨论

越来越多的研究结果表明，circRNA 在许多恶性肿瘤的发生发展中起着关键的调节作用[16]。随着高通量测序及先进的生物信息学技术的发展，许多circRNA 被鉴定出来，这使得circRNA 与肿瘤的关系比以往更受关注。circRNA 的异常表达已被证实与NSCLC 的进展有关，如circRNA_100876在NSCLC 组织中的表达水平明显高于邻近的非肿瘤组织，circRNA_100876 的表达上调与NSCLC患者的淋巴结转移和肿瘤分期有关[17]。此外，circRNA_100876 表达水平较高的NSCLC 患者的总生存时间明显短于circRNA_100876 表达水平较低的NSCLC 患者[17]，故某些circRNA 对NSCLC的发生、发展及诊断治疗可能有重大意义。目前，关于circRNA_0128846 与肿瘤的关系仅有1 篇文献报道，其研究结果显示，circRNA_0128846 在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常组织，circRNA_0128846 通过下调miR-1184 的表达来增加LIM 结构域蛋白（AJUBA）的表达，使得Hippo/Yes 相关蛋白（YAP）通路信号失活，从而促进结直肠癌的发生[18]。在本研究中，我们通过生物信息学分析发现circRNA_0128846 在人NSCLC 细胞中显著高表达。

目前，关于circRNA 与肿瘤放射敏感性关系的报道还不多见。研究结果表明，circZNF609 在前列腺癌组织和细胞系中异常上调，其通过调控miR-501-3p/已糖激酶2（HK2）轴促进糖酵解代谢，从而增强前列腺癌细胞的放射抵抗[19]。circ_0086720 通过靶向miR-375/纺锤体蛋白1（SPIN1）轴促进NSCLC 放射抵抗[20]。下调circ_CCNB2 可抑制miR-30b-5p/驱动蛋白家族成员18A（KIF18A）轴介导的细胞自噬，增强前列腺癌细胞的放射敏感性[21]。在本研究中，我们发现circRNA_0128846在人NSCLC 放射抵抗细胞中显著高表达，沉默circRNA_0128846 能显著增强人NSCLC 细胞的放射敏感性，过表达circRNA_0128846 能显著降低人NSCLC 细胞的放射敏感性，circRNA_0128846 可作用于miR-1183，促进人NSCLC 细胞的放射抵抗。

circRNA 发挥生物学功能的重要途径之一就是作为分子海绵吸附miRNA。大量研究结果证实miRNA 参与炎症[22]、心脏病[23]、肿瘤[24]等多种疾病的发生、发展。目前，关于miR-1183 的研究还较少。miR-1183 可通过调控B 细胞淋巴瘤基因2（Bcl2）的表达参与风湿性心脏病的发生、发展过程[25]。在肿瘤中，miR-1183 是circRNA_0073239和circRNA_0005273 调控肿瘤细胞增殖、迁移、糖酵解的重要下游靶标[26-28]。Zhu 等[26]的研究结果表明，miR-1183 是circRNA_0073239 介导胶质瘤放射抵抗的下游靶标。本研究通过人类环状RNA 数据库和circinteractome 数据库预测并验证了circRNA_0128846 的下游靶标miR-1183，并发现其可能是circRNA_0128846 介导人NSCLC 细胞放射抵抗的重要靶标。我们发现，通过过表达miR-1183 显著增强了人NSCLC 细胞的放射敏感性，而沉默miR-1183 显著降低了人NSCLC 细胞的放射敏感性。

关于miR-1183 下游靶标的研究不多，B 细胞淋巴癌基因2（Bcl2）和磷脂酰肌醇依赖性激酶1（pPDPK1）是miR-1183 的下游靶标。在前期，我们通过TargetScan 和miRbase 数据库分析预测了miR-1183 可能的下游靶标，其中包括鼠双微体2（mouse double minute 2，MDM2）和缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1），这些基因已被证实参与肿瘤的放射抵抗[29-30]。MDM2 作为一种癌基因，能调节抑癌基因p53 对细胞周期和凋亡的调控[31]。多项研究结果表明，MDM2 在肿瘤对辐射反应的过程中发挥关键作用[32]。HIF-1 是一种关键的转录因子，可使肿瘤细胞适应缺氧条件[33]。放疗可以加速HIF-1 的激活，而HIF-1 反过来可通过多条信号途径影响辐射反应[34-35]。这些基因可能是miR-1183 调控肿瘤放射敏感性的重要靶标。本研究中，circRNA_0128846 在人NSCLC 放射抵抗细胞中的表达显著上调，而miR-1183 的表达下降，circRNA_0128846 可通过靶向结合并抑制miR-1183的表达，进而降低人NSCLC 细胞的放射敏感性，这提示circRNA_0128846 在NSCLC 的放射抵抗中发挥重要作用，其可能成为一种潜在的治疗靶点，但具体的作用机制还需进一步探究。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明陆滢负责实验的实施、论文的撰写；邓鑫州负责图像的分析、数据的处理、论文最终版本的修订；宋仕茂负责生物信息学的分析、论文摘要的校对；骆志国负责命题的提出、论文的审阅