一种全新腔肠素化合物的合成

梁 辉，符秀娟，陈俊波，胡伟利

(1 海南爱科制药有限公司，海南 海口 571100；2 海南职业技术学院药学教研室，海南 海口 570216)

生物荧光成像技术是利用荧光素酶和相应的底物进行氧化还原反应从而产生光能量的一种技术。此技术目前已经大量使用在生命科学技术研究领域，比如细胞增殖、肿瘤分化、蛋白相互作用等等。

目前生物发光研究领域中，海肾荧光素酶和腔肠素底物是该领域比较热门的研究体系之一，从它们被科学家们发现至今，已有许多腔肠素衍生物被设计并合成出来。科学家们对腔肠素衍生物的结构修饰的目的主要有：一是使得它的发射波长向红外移动更多，如此发射的光相对不易被吸收，使得成像更方便。二是加大衍生物的稳定性，使之不易被水解或氧化分解，进而加强背景信号。三是发光的强度得以增加，发光时间得以延长。

天然腔肠素主要来自于海洋发光生物，比如水母、海蜇、海肾等[1-2]。腔肠素衍生物应用非常广泛，其主要应用在以下方面：活体成像、实体肿瘤切除手术引导；报告基因检测；检测细胞/组织内活性氧(ROS)水平，细胞和组织内的超氧阴离子和过氧化亚硝基阴离子能够增强腔肠素在酶非依赖性的氧化体系中自发荧光；药物研发高通量筛选；监测活细胞内钙离子水平[2-5]。

天然腔肠素由于存在着诸多缺点，科学家们在腔肠素母核的C-2、C-5、C-6和C-8处做了修饰改变[6-8]，许多腔肠素衍生物被合成出来，但是由于海肾萤光素酶的高度底物特异性，很少能比天然腔肠素更有优势。因此，寻找活性更好的海肾萤光素酶发光体系己经成为一个热点，同时也是一个难点[8-10]。

目前对于腔肠素衍生物的研究主要是基于天然型腔肠素底物，但由于天然型底物存在发光波长短，穿透力差，荧光强度较弱，发光时间短和水溶性差等缺点，阻碍了腔肠素衍生物的进一步研究[11]。根据文献查询结果，腔肠素衍生物构效关系研究较少，为改善以上缺点，本研究进行了5位碳的结构修饰和合成路线工艺研究，以期获得发光强度、穿透力、水溶性都较好的腔肠素衍生物。为以后在此结构为底物基础上合成并筛选具有生物活性的化合物有较大的实际意义[12]。

本次合成路线设计为以6-甲基2-氨基吡嗪为原料，先溴代反应得到6-甲基- 5-溴-2-氨基吡嗪，再与对叔丁基二甲基硅氧基苯硼酸反应，再次溴代反应得到6-甲基-5-对叔丁基二甲基硅氧基苯-3-溴--2-氨基吡嗪， 与取代硼酸进行偶联反应后经缩合反应合成了1个 C-5位腔肠素衍生物化合物[13]。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

DF-101S集热式加热磁力搅拌器，济南欧莱博科学仪器有限公司；APS-8-26高效液相色谱仪，日本岛津公司；GC-2014气相色谱仪，日本岛津公司。

合成所用试剂均为分析纯，分析所用为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 合 成

化合物合成路线设计如下：

图1 化合物合成路线Fig.1 Synthetic route of compounds

(1)化合物1的合成

备好冰浴锅，安装好反应体系，在三角瓶中加入50 mL三氯甲烷，然后加入2.4 g(20 mmol)原料6-甲基-2-氨基吡嗪，缓慢搅拌溶解，使反应溶液降温至0 ℃，缓慢加入NBS 溴代丁二酰亚胺3.6 g(20 mmol)，加完后撤掉冰浴锅，使反应溶液缓慢升温至室温，适当的搅拌速度下使反应体系反应12 h。经点板薄层分析，确认可以停止反应，进行后处理，布氏漏斗过滤，少量三氯甲烷洗涤，滤液收集后，旋转蒸发仪浓缩滤液，所得混合物硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇=25:1，F/F)。洗脱液浓缩得到白色固体2.35 g，收率61%。1H NMR δ: 8.11(d，J=0.9 Hz,1 H)，7.82(d，J=1.1 Hz，1 H)，4.78(brs，2 H),1.25(s,3 H)。

(2)化合物2的合成

安装好反应体系后，在氮气保护下往反应器中加入化合物1，加入量为1.8 g(9 mmol)，加入硼酸3.5 g(13.5 mmol)，加入三苯基膦氯化钯0.7 g(0.9 mmol)，缓慢的滴加甲苯70 g，滴加完毕再缓慢加入2 mol/L的碳酸钠溶液10 mL，加热反应溶液直至使溶液回流，在回流状态下反应4 h。经点板薄层分析，确认可以停止反应，进行后处理，布氏漏斗过滤，收集滤液，使用三氯甲烷分三次萃取，每次30 mL，合并萃取液，使用无水硫酸镁干燥剂干燥过夜。干燥后的萃取液经布氏漏斗过滤，少量三氯甲烷洗涤滤饼，收集滤液进行浓缩，所得混合物硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇=20:1，F/F)。洗脱液浓缩得到白色固体2.83 g，收率81%。1H NMR δ:8.42(d，J=1.4 Hz,1 H)，8.11(d，J=1.4 Hz，1 H)，7.72(d，J=8.8 Hz，2 H)，6.88(d ，J=8.7 Hz，2 H)，4.60(brs,2 H),1.46(s,3 H),1.05(s,9 H),0.24(s,6 H)。

(3)化合物3的合成

备好冰浴锅，安装好反应体系，在三角瓶中加入DMSO 25 mL，加入2.5 g(7 mmol)的化合物2，加入0.5 mL水，搅拌溶解。冰浴将反应溶液降至0 ℃，缓慢滴加NBS 溴代丁二酰亚胺1.5 g(8 mmol)，加完升温至室温，反应15 h。经点板薄层分析，确认可以停止反应，进行后处理，往反应液中加入25 mL水中，用三氯甲烷萃取，饱和食盐洗涤，无水硫酸镁干燥过夜。干燥后的萃取液经布氏漏斗过滤，少量三氯甲烷洗涤滤饼，收集滤液进行浓缩，所得混合物硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇=25:1，F/F)。洗脱液浓缩得到白色固体2.4 g，收率82%。1H NMR δ:8.42(s，1 H)，7.78(d, J=8.8 Hz, 2 H),6.93(d, J=8.8 Hz, 2 H)，5.11(brs，2 H),1.35(s,3 H)，0.99 (s，9 H)，0.22(s，6 H)。

(4)化合物4的合成

安装好反应体系，在氮气保护下，往三角瓶中加入Zn粉2.0 g(30.6 mmol)和I2200 mg，加入无水四氢呋喃15 mL，加入无水DMF 10 mL，室温反应至碘棕色消失。缓慢加入苄基溴1.5 mL(12 mmol)，将反应液缓慢加热升温至80 ℃，反应6 h后停止加热，使反应溶液慢慢降温至室温，得到混合液1。安装另外一个反应体系，在另外一个三角瓶中，加入2.2 g的化合物3，加入三苯基膦氯化钯0.3 g(0.35 mmol)，缓慢加入15 mL无水DMF和20 mL无水四氢呋喃，得到混合液2。将混合液2缓慢加入混合液1中，室温反应过夜。经点板薄层分析，确认可以停止反应，进行后处理，布氏漏斗过滤，收集滤液，使用三氯甲烷分三次萃取，每次30 mL，合并萃取液，使用无水硫酸镁干燥剂干燥过夜。干燥后的萃取液经布氏漏斗过滤，少量三氯甲烷洗涤，收集滤液进行浓缩，所得混合物硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇=20:1，F/F)。洗脱液浓缩得到淡黄色固体2.1 g，收率55%。1H NMR δ:8.45(S，1 H)，7.90(J=6.9 Hz，2 H)，7.40(J=7.2 Hz，2 H，)，7.35(m，5 H)，6.42(s，2 H)，4.09(s，2 H)，1.35(s,3 H)，1.02 (s，9 H)，0.23(s，6 H)。

(5)化合物5的合成

安装好反应体系，在氮气保护下，往三角瓶中加入0.3 mmol的化合物4，加入10 mL无水乙醇，适当搅拌速率下使之溶解，加入1，1-二乙氧基-3-对羟基苯基丙酮0.6 mmol，加入浓盐酸1.0 mL，缓慢加热至反应溶液回流，回流反应过夜。经点板薄层分析，确认可以停止反应，进行后处理，布氏漏斗过滤，收集滤液进行浓缩，所得混合物硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇=20:l，F/F)。洗脱液浓缩得到淡黄色固体0.25 g，收率35%。1H NMRδ: 8.24(d,J=8.3 Hz,1 H),7.92(d,J=7.6 Hz,1 H),7.76(d,J=8.2 Hz,2 H),7.69(d, J=7.1 Hz,1 H),6.62(d,J=8.4 Hz,2 H),3.90(s,2 H)，1.36(s,3 H)，1.01 (s，9 H)，0.24(s，6 H)。13C NMR δ:157.2, 156.4,152.8,149.2, 143.1, 142.5, 13 8.0, 131.1, 128.9,127.4, 125.3, 121.1, 116.4, 113.2, 111.3, 27.8。

2 讨 论

经过两步的溴代反应和两步的偶联反应，最后缩合闭环反应，其中需要注意反应条件的把控，特别是惰性气体的保护措施、反应温度，否则会严重影响反应，导致副产物增多和影响收率[14]。第一步到第三步的反应收率尚可，后面的化合物4和5的收率偏低，我们进行了合成条件的摸索，以提高收率。

化合物4的合成中，混合液1和混合液2的混合温度、反应温度对反应正向进行影响较大，温度太低了反应进度极其缓慢，温度太高了，副反应和副产物太多，所以，我们设计四个温度维度来探索影响产率的温度。根据反应条件，记录反应情况，结果如表1所示。

表1 反应温度对化合物4合成收率的影响

由表1得知，反应温度为0 ℃时，反应向右进行非常缓慢，已经反应了48 h依然未能完全反应，仍然留有原料混合液1和混合液2在反应体系中，收率也不高，才不到40%。对于实验室条件下的需求，反应时间相对较长，维持0 ℃长时间反应的能耗较高，因此，不是最优选。而提高反应温度以提高反应速度，分别设置40 ℃和80 ℃两档，很显然，反应时间显著缩短，最短可以是4 h即可完全反应，但由于反应温度过高，副产物较多，产物收率未能超过50%。实验结果为温度为室温25 ℃是最佳温度条件，如此反应比较温和，副产物也少，无需加热或制冷，反应能耗需求最低，因此，化合物4的合成温度条件摸索结果为25 ℃。

化合物5是缩合闭环反应，由于分子量增大，又有一定的空间位阻，因此缩合反应需要激烈的反应条件才能更好的向右进行，可是温度过高时会产生大量副反应副产物，因此严重影响化合物收率。我们设置了三个温度梯次来考查反应温度对收率的影响。结果如表2所示。

表2 反应温度对化合物5合成收率的影响

首先是在室温条件下反应，其反应时长较久，反应不能完全，经过48 h反应后，仍然有大量化合物4原材料未反应，因此收率自然较低。反应温度提高到40 ℃，反应速度有所加快，但是反应时间依然超过一天，对于实验室条件下摸索打通合成路线这样的需求，应该考虑尽量加快反应，减少时间成本。由此设置乙醇回流反应过夜，原料大部分基本都反应了，但温度较前有所提高，副产物也较前增多不少，收率也就只有35%左右，产出不理想，但在所针对反应温度维度设计中，回流过夜为最佳条件。也许还可以再通过摸索水解条件或其他反应条件来改善和提高反应产率，此设想留作他日摸索。

3 结 论

通过以上实验，我们得知，整个合成路线经历了五步反应，分别是两步溴代反应、两步欧联反应和一步缩合反应，溴代反应和欧联反应的合成收率相对较高，缩合反应收率较低，总收率为7.79%，因此需要优化反应条件。我们对化合物4和5进行了反应条件的摸索，结果是：化合物4的合成中，最佳反应温度为室温，可以得到最高收率55%；化合物5的合成中，最佳反应温度为回流，反应收率为35%。

我们此次项目目标是设计合成路线，并合成得到化合物5，因此，反应条件的优化不是最紧迫任务。化合物5目标产物的生物活性正在试验以验证其离子稳定性、发光强度和发光时长。我们后期也希望能够就C-5位改造物基础上，再进行其他位置的修饰，以期获得稳定性好，发光强度大和发光时长较长的腔肠素衍生物。