延胡索生物碱的分离纯化及抗炎作用研究

江明达,包文丽, 徐 宁,于佳琪,许 良

(内蒙古民族大学天然产物化学及功能分子合成自治区重点实验室，内蒙古 通辽 028000)

蒙药延胡索是罂粟科植物延胡索的块茎，其味辛、苦、性温、归心、肝、脾经，具有活血化瘀、理气止痛的功效[1]。目前从延胡索中分离40多种生物碱类化合物，可分为原小檗型、阿朴啡型、原阿片型、异喹啉苄咪唑啉型、异喹啉苯并菲啶型和双苄基异喹啉型等生物碱[2-10]，同时还有甾体类、蒽醌类、有机酸类、糖类等化合物[11-14]。在现代药理研究中，延胡索生物碱是消炎阵痛的主要生物活性化合物之一，其中延胡索乙素的镇静催眠作用最强，延胡索丑素次之，而延胡索奎素最差[15-16]。Leung等[17]通过高架迷宫(一种用于抗焦虑评估的行为模型)证实当给小鼠口服低剂量的延胡索乙素时，能够较好的缓解小鼠的焦虑症状。延胡索能够解除坐骨神经慢性压迫性损伤所致神经病理性疼痛，其镇痛程度甚至能够达到典型镇痛药吗啡作用的40%[18]。除此之外，延胡索具有抗肿瘤、抗溃疡、抗肝损伤、抗心肌缺血等作用[20-26]。

分子对接技术是依据配体与受体作用的“锁-钥原理”，模拟配体小分子与受体生物大分子相互作用的一种技术方法。配体与受体相互作用是分子识别的过程，主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等。通过计算，可以预测两者间的结合模式和亲和力发现配体-蛋白的相互作用方式，用于解释生物学实验、为发现活性化合物提供指导。分子对接作为一种虚拟筛选工具，特别适合从药用植物中筛选出可呈药性的先导化合物，从而降低实验筛选化合物的数量，进而缩短研究周期。

本研究采用75%乙醇为溶剂，经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，获得乙酸乙酯部位，采用色谱技术分离纯化延胡索中生物碱成分，并应用分子对接技术筛选生物活性化合物，为蒙药延胡索的开发利用奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；RE-2002旋转蒸发器，郑州仪器设备有限公司；SHZ-CB循环水式多用真空栗，巩义市子华仪器有限责任公司；KQ-250DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FA2104N电子分析天平，上海民桥精瓷科学仪器有限公司；DHG-9140鼓风干燥箱，上海赛欧试验设备有限公司；B-220恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；JIDI-UP超纯水机，广州吉迪仪器有限公司；LC-6AD半制备高效液相色谱仪，日本岛津有限公司；Bruker Avance 500 MHz核磁共振波谱仪，德国Bruker公司；ZF-8N智能暗箱式四用紫外分析仪，上海嘉鹏科技有限公司。

1.2 试 剂

无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、二氯甲烷，分析纯，天津大茂化学试剂厂；柱层硅胶、薄层硅胶、化学纯，青岛海洋化工有限公司。

2 实验方法

2.1 延胡索化学成分的分离纯化

称取3.0 kg粉碎延胡索，用75%乙醇浸泡24.0 h，加热回流提取后3.0 h，减压浓缩回收乙醇获得浸膏。将浸膏用石油醚层、乙酸乙酯和正丁醇依次进行萃取，再以甲醇-水为流动相经过反相C18柱将乙酸乙酯部位进行梯度洗脱，收集馏分Fr 1～Fr 5。

Fr 1采用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷-甲醇体系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脱，获得馏分Fr 1.1～10。Fr 1.3和Fr 1.7经过反复硅胶柱层析和硅胶薄层层析纯化，获得化合物1、2和3。

Fr 2采用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷-甲醇体系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脱，获得馏分Fr 2.1～18。Fr 2.2在室温下析出固体，过滤，固体用二氯甲烷反复重结晶，获得化合物4。滤液经硅胶柱层析分离，以二氯甲烷-甲醇体系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脱，获得馏分Fr 2.2.1～Fr2.2.16。Fr 2.2.2经过反复硅胶柱层析和硅胶薄层层析纯化，获得化合物化合物5和6。Fr 2.2.4经过反复硅胶薄层层析纯化，获得化合物7和8。Fr 2.6采用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷-甲醇体系(30:1)洗脱，经薄层层析检测合并，再用半制备高效液相色谱纯化，获得化合物9和10。

Fr 3采用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷-甲醇体系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脱，获得馏分Fr 3.1～3.14。Fr3.2继续用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷-甲醇体系(80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1)洗脱，收集馏分Fr 3.2.1～3.2.7。Fr 3.2.1经反复硅胶薄层层析纯化，获得化合物11和12。

2.2 蛋白质靶点的筛选

根据生物信息学和多种数据库中筛选出与抗炎相关的3个蛋白(COX-2、1S1R、1DVX)，下载蛋白的3D结构并保存。

2.3 分子对接Auto Dock

Auto Dock由Scripps 研究所的Olson实验室开发与维护，运用拉马克遗传算法来计算配体与受体之间最佳的结合状态。Auto Dock软件由Auto Grid和Auto Dock两个程序组成，还具备分子可视化辅助对接软件 Auto Dock Tools程序。将下载的蛋白受体的3D结构以及蒙药延胡索中分离出的12个化合物(四氢小蘖碱、巴马汀、延胡索乙素、去氢紫堇碱、四氢紫堇萨眀、异紫堇球碱、四氢非洲防己胺、d-紫堇碱、四氢黄连碱、海罂粟碱、脱氢海罂粟碱、普鲁托品)导入到对接软件Auto Dock Tools中进行运算，得出对接自由能及一类构象数量。

3 结果与讨论

3.1 化合物的鉴定

从蒙药延胡索中分离出12个化合物，经1H NMR和13C NMR鉴定，它们分别为去氢紫堇(1)、延胡索乙素(2)、d-紫堇碱(3)、四氢小蘖碱(4)、四氢非洲防己胺(5)、四氢巴马汀(6)、四氢黄连碱(7)、四氢紫堇萨眀(8)、异紫堇球碱(9)、海罂粟碱(10)、脱氢海罂粟碱(11)、普鲁托品(12)，见图1。

图1 化合物1～12结构Fig.1 Strcture of compound 1～12

3.2 化合物1～12与蛋白COX-2作用

计算蒙药延胡索中化合物与靶点蛋白的自由能以及一类构象数量来评估小分子的活性，其中接自由能反应了配体与蛋白之间的亲和力结合能与对接的好坏成反比，自由能越低对接结果越稳定。一类构像数量是指最优构象相似的对接结果，数值越大，反应小分子在蛋白此位置结合的构象越多。

通过Auto Dock软件计算12个生物碱化合物和蛋白COX-2的结合自由能，结果见表1和表2。从表中可以看出，延胡索中去氢紫堇、延胡索乙素、d-紫堇碱、四氢小蘖碱、四氢非洲防己胺、四氢巴马汀、四氢黄连碱、四氢紫堇萨眀、异紫堇球碱、海罂粟碱、脱氢海罂粟碱、普鲁托品与蛋白COX-2的最低结合自由能均低于-6.5，说明其与蛋白结合较好。其中普鲁托品的最低自由能值最小，显示出较强潜在的抗炎活性。

表1 化合物1～6与蛋白COX-2的结合自由能

表2 化合物7～12与蛋白COX-2的对接自由能

3.3 化合物1～12与蛋白1S1R作用

通过Auto Dock软件计算12个生物碱化合物和蛋白1S1R的结合自由能，结果见表3和4。从表中可以看出，除四氢紫堇萨眀外，延胡索中去氢紫堇、延胡索乙素、d-紫堇碱、四氢小蘖碱、四氢非洲防己胺、四氢巴马汀、四氢黄连碱、四氢紫堇萨眀、海罂粟碱、脱氢海罂粟碱、普鲁托品与蛋白1S1R的最低结合自由能均低于-6.5，说明其与蛋白结合较好。其中四氢小蘖碱的最低自由能值最小，显示出较强潜在的抗炎活性。

表3 化合物1～6与蛋白1S1R的结合自由能

表4 化合物7～12与抗炎蛋白1S1R的对接自由能

3.4 化合物1～12与蛋白1DVX作用

通过Auto Dock软件计算12个生物碱化合物和蛋白1DVX的结合自由能，结果见表5和表6。从表5和表6中可以看出，延胡索中去氢紫堇、延胡索乙素、d-紫堇碱、四氢小蘖碱、四氢非洲防己胺、四氢巴马汀、四氢黄连碱、四氢紫堇萨眀、异紫堇球碱、海罂粟碱、脱氢海罂粟碱、普鲁托品与蛋白1DVX的最低结合自由能均低于-6.5，说明其与蛋白结合较好，但弱于蛋白COX-2和1S1R。其普鲁托品的最低自由能值最小，显示出较强潜在的抗炎活性。

表5 化合物1～6与蛋白1DVX的结合自由能

表6 化合物7～12 与抗炎蛋白1DVX的对接自由能

4 结 论

蒙药延胡索是蒙医常用药材，具有消炎镇痛作用。在分子对接研究中，延胡索含中生物碱原小檗碱型生物碱四氢小蘖碱、巴马汀、延胡索乙素、去氢紫堇碱、异紫堇球碱、四氢非洲防己胺、d-紫堇碱、四氢黄连碱，阿朴啡型生物碱海罂粟碱、脱氢海罂粟碱，原阿片型生物碱普鲁托品与抗炎蛋白COX-2、1S1R、1DVX均有较高的亲和力，表明延胡索中生物碱可与多个靶点蛋白结合，具有潜在的抗炎生物活性，但仍需要通过体内活性实验验证。