基于PI3K/Akt信号通路探讨雄性激素对慢性心力衰竭心肌细胞凋亡的影响

胡阳 邓洁 王婷婷 姜华 罗勇 杨永丽 苏慧鹏 王煜

(昆明医科大学附属延安医院 1老年病科，云南 昆明 650000；2消化科；3云南省楚雄州武定县人民医院心内科)

慢性心力衰竭(CHF)是各种心血管疾病发展的最终阶段，由于心肌收缩力减退，致前向血流减少和肺静脉系统血流回流障碍，而交感神经系统及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS) 的激活起代偿作用。RAAS在心室重塑、心力衰竭(HF)的发展过程中起到重要作用。近年研究发现CHF时雄激素水平降低，雄激素水平下降又加重心功能不全。CHF患者雄激素水平降低,其可能参与了HF的病理生理过程。雄激素补充治疗有可能通过激活磷脂酰激酶-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路改善心血管功能、增加运动强度与时间、抑制导致CHF进程的神经激素。本研究探讨雄激素对CHF大鼠心功能的影响。

1 材料与方法

1.1材料和试剂 成年雄性SD大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(许可证号：SCXK(湘)2016-0002)。PI3K/Akt阻断剂(LY294002)购自Selleck公司。盐酸阿霉素(ADR)购自山西普德药业有限公司(国药准字H14023143)。丙酸睾酮(T)购自宁波第二激素厂(兽药字(2016)110251054)。p-Akt抗体购自CST公司(货号：9271)。Akt抗体购自CST公司(货号：9272)。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗体购自CST公司(货号：9662)。TUNEL试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(货号：C1082)。主要设备：MindrayM7便携彩超诊断仪。

1.2CHF模型建立 成年雄性SD大鼠55只，体重220～250 g，8月龄以上，随机分为对照(Control)组(10只)、CHF组(15只)、T+CHF组(15只)、LY294002+T+CHF组(15只)。CHF采用腹腔注射ADR，第2天、第4天ADR 1 mg/kg；第6天、第8天ADR 2 mg/kg；第10、第12天ADR 3 mg/kg；第14、第16天ADR 4 mg/kg。T干预是在开始注射ADR同时经过皮下注射丙酸T，每次剂量为2 mg/kg,每2 d 1次，共15次,累积剂量达30 mg/kg。抑制组建模：LY294002干预是在开始注射ADR同时每天腹腔注射LY294002 50 mg/kg。而Control组和CHF组皮下注射相等体积的花生油及腹腔注射相等体积的生理盐水。

1.3CHF模型的评估鉴定 ADR给药30 d后使用MindrayM7便携彩超诊断系统行超声心动检测。异氟烷吸入麻醉大鼠，心前区备皮，仰卧位固定。检测评估大鼠左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室收缩期内径(LVDs)、室间隔厚度(IVS)、心率(HR)、心脏射血分数(EF)，所有超声测量值取3个心动周期的平均值。

1.4测定血清雄激素水平 于ADR给药30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，采用20 μl的毛细管对大鼠进行眼内眦静脉丛采血,收集静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管内,4℃冰箱放置30 min,3 000 r/min离心15 min,吸取血浆,分装后置于-80℃,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中雄激素含量。具体步骤参照试剂盒说明书。

1.5TUNEL法测定心肌细胞凋亡指数 于ADR给药30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后处死，用4℃磷酸盐缓冲液(PBS)将心脏中血液冲洗干净，在-80℃冷冻2 h。用冰冻切仪切成6 μm切片，切片应用TUNEL凋亡检测试剂盒进行检测，使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)对凋亡细胞的DNA进行标记，通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素检测试剂对TdT标记，用二氨基联苯胺(DAB)显色。并且光镜下观察，凋亡细胞阳性呈现棕黄色染色，正常为蓝色。采用Image-ProPlus6.0软件计数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，并计算凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100%。

1.6Western印迹检测Caspase-3、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达 为了探讨PI3K/Akt通路是否为雄激素改善心功能通路之一，本研究采用抑制剂LY294002对PI3K/Akt信号通路进行阻断及补充雄激素。于ADR给药30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，用4℃ PBS将心脏中血液冲洗干净，取心肌组织，使用组织匀浆器及RIPA裂解液提取心肌组织蛋白，使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对提取的蛋白进行电泳，并使用聚偏氟乙烯(PVDF)膜转，按照不同分子量切取蛋白条带按照对应蛋白孵育一抗，使用山羊抗小鼠和山羊抗兔的二抗按照一抗来源不同孵育二抗，采用电化学发光(ECL)底物进行显色反应，用Image J 软件进行灰度分析。

1.7免疫组化检测心肌组织中Caspase-3、p-PI3K、p-Akt 蛋白的表达 为进一步验证雄激素改善心功能通过激活PI3K/Akt通路减少心肌细胞凋亡，本研究将1.5步骤中冰冻切片通过3%H2O2去除内源性的过氧化氢酶，使用羊血清对切片进行封闭，分别按照Caspase-3(1∶100)、p-PI3K (1∶200)、p-Akt(1∶100)的一抗进行孵育，使用免疫组化通用二抗试剂盒孵育，用DAB进行显色，使用苏木素复染、梯度酒精常规脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光镜下观察Caspase-3、p-PI3K、p-Akt蛋白表达情况，采用Image-ProPlus6.0软件分析蛋白的表达情况。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD法，统计图用GraphPad Prism6.0 软件绘制。

2 结 果

2.1模型制作存活率 55只SD大鼠建模中死亡12只，分别为CHF组5只，T+CHF组3只，LY294002+T+CHF组4只，存活率为78.2%。

2.2各组心功能比较 与Control组比较，其余3组LVDd、LVDs明显增大，EF明显降低(P<0.05)。与CHF组比较，T+CHF组LVDd、LVDs、EF无统计学差异(P>0.05)，而HR明显减慢(P<0.05)。与T+CHF组比较，LY294002+T+CHF组LVDd、LVDs无统计学差异(P>0.05)，而HR明显加快，EF明显降低(P<0.05)。各组IVS组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 ADR干预30 d各组心功能改变

2.3各组血清雄激素水平比较 与Control组〔(0.462±0.029)ng/ml〕比较，CHF组T水平〔(0.367±0.027)ng/ml〕明显降低(P<0.05)；与CHF组比较，T+CHF和LY294002+T+CHF组血清T水平〔(0.519±0.018)、(0.528±0.068)ng/ml〕明显升高(P<0.05)。

2.4TUNEL法测定CHF大鼠心肌细胞凋亡 ADR干预各组心肌细胞内可见较多棕色细胞核碎裂颗粒，提示心肌细胞发生凋亡，见图1。CHF组TUNEL阳性细胞数〔(33.835±5.819)个〕、Caspase-3蛋白表达(0.993±0.058)明显高于Control组〔(17.204±3.825)个、0.305±0.011；P<0.05〕；T+CHF组TUNEL阳性细胞数〔(20.235±8.172)个〕、Caspase-3蛋白表达(0.505±0.010)较CHF组明显改善(P<0.05)；LY294002+T+CHF组TUNEL阳性细胞数〔(30.125±4.314)个〕、Caspase-3蛋白表达(0.696±0.052)明显高于T+CHF组(P<0.05)，与CHF组无明显差异(P>0.05)。见图2。提示补充雄激素减轻CHF大鼠的心肌细胞凋亡，且减轻心肌细胞凋亡的途径与LY294002抑制的信号通路有关。

图1 TUNEL法检测各组心肌凋亡细胞(HE染色，×400)

1～4：Control组,CHF组,T+CHF组,LY294002+T+CHF组图2 Western印迹检测各组Caspase-3、 p-Akt、p-PI3K/Akt蛋白表达

2.5LY294002对PI3K/Akt信号通路阻断检测 与Control组p-Akt/Akt及p-PI3K/Akt蛋白表达(1.604±0.053、0.692±0.019)比较，CHF组(0.801±0.024、0.410±0.015)、T+CHF组(1.266±0.020、0.503±0.000)、L294002+T+CHF组(0.216±0.017、0.210±0.006)均明显降低(均P<0.05)；与CHF组比较，T+CHF组明显上升(P<0.05)；与T+CHF组比较，LY294002+CHF组明显降低(P<0.05)，见图2。表明LY294002抑制剂可以在心肌中抑PI3K/Akt通路，同时说明雄激素可以激活PI3K/Akt通路。

2.6免疫组化检测心肌组织中p-Akt、p-PI3K、Caspase-3蛋白表达水平 LY294002抑制剂加入后p-AKT、p-PI3K蛋白表达降低而Caspase-3蛋白表达升高，补充雄激素后p-Akt、p-PI3K蛋白表达升高而Caspase-3蛋白表达下降。见图3。进一步表明雄激素可能通过PI3K/Akt通路减轻心肌细胞凋亡从而改善心功能。

图3 免疫组化检测心肌组织中p-Akt、p-PI3K、Caspase-3蛋白表达(×200)

3 讨 论

正常情况下T是维持生命体各脏器功能及结构的重要内分泌激素，T对维持心脏功能及结构也起到一定作用。近年来研究发现心血管系统对雄激素特别敏感，雄激素直接影响心血管系统的血管和心脏，血清T浓度会随着年龄的增长而降低，T水平的降低与过早的冠状动脉疾病、对动脉粥样硬化性心血管疾病危险因素的不利影响及与年龄无关的心血管死亡风险的增加有关〔1〕。越来越多的证据表明激素缺乏在CHF中起着重要作用〔2～6〕。特别是雄激素缺乏在CHF患者中很常见，并且与发病率和死亡率的增加有关〔7,8〕。

Jankowska等〔9〕对208例CHF患者和366名健康男性进行对照研究，所有纽约心脏协会(NYHA)心功能分级的HF中都发现了较低的T水平。研究表明〔10〕，男性CHF患者T水平降低预示预后不良，并与死亡率增加有关。有研究也证实在CHF患者及大鼠外周循环中雄激素较正常对照组是降低的〔11,12〕。因此雄激素在HF患者中被证实是普遍减少的，但补充雄激素对改善心功能的是有分歧的。一项前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照试验〔13〕比较CHF合并射血分数降低(HFrEF)的T缺乏男性患者用T替代与安慰剂的疗效，每3个月肌肉注射长效十一酸T固定剂量为1 000 mg。安慰剂组接受等渗盐水血清，患者在接受最佳药物治疗的同时，随机分为T或安慰剂组，研究进行了12个月，最终样本包括29例患者，安慰剂组15例，T组14例〔年龄(65±8)岁，62%有缺血的病因，左室射血分数(LVEF)为(30±6)%，NYHA心功能分级Ⅱ占 69%〕。12个月后，T替代组T水平明显增加(P=0.002)，但在临床症状和功能方面〔包括NYHA分级、弗雷明汉评分、明尼苏达生活性CHF问卷、6 min步行距离(6MWD)、LVEF及距离N末端前脑钠肽(NT-proBNP)〕未见获益。未观察到T治疗相关的明显不良反应。在其他激素、代谢和骨代谢生物标志物中没有发现影响。在HFrEF和T缺乏症患者中，替代治疗无显著成效。而另一项研究〔14〕选取50岁男性患有充血性HF的患者,安慰剂对照试验和试验组，试验组肌肉(臀部)长效注射雄激素T(庚酸T 250 mg/ml)；对照组接受肌内注射生理盐水(1 ml)。两组患者体重、血流动力学参数及左室容积超声心动图指标均具有可比性。对于舒张功能状态的改变，使用心肌做功指数，使用睾酮后该参数得到明显改善。与接受安慰剂的组不同，接受T组在研究期间的6MWD参数有显著增加的趋势(P=0.019)。在调整基线变量后，各研究组之间的6MWD变化趋势差异仍然显著(F=4.402,P=0.045)。本研究加强了对T在改善CHF患者功能能力和生活质量中的有益作用。证实了适量补充雄激素可能有助于改善心功能。

目前有关雄激素在HF中的机制研究较少且不明确，有研究〔15〕认为核因子(NF)-κB信号可能是T治疗心肌益处的重要分子基础。T有广谱的免疫调节作用，可抑制巨噬细胞的活性，降低血浆肿瘤坏死因子(TNF)-α，研究发现T可抑制NF-κB的激活，上调NF-κB抑制物(Iκ-B)的表达，间接抑制中性粒细胞CD11/CD18的表达，从而抑制炎症因子分泌。低T水平被发现与增加代谢风险和系统炎症有关。由于脂肪组织是炎性细胞因子的来源，T可能通过作用于脂肪组织来调节炎症。在冠状动脉疾病、前列腺癌和糖尿病患者中观察到T可能抑制炎症反应，通过抗炎细胞因子白细胞介素(IL)-10的增加和减少促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)来达到〔16〕。T缺乏与促炎细胞因子增加有关，T替代降低促炎细胞因子。也有动物实验〔17〕证实T替代治疗能减轻衰老大鼠心肌纤维化和凋亡，并认为至少部分通过提高生长停滞特异性蛋白(Gas)6的表达而减轻心肌纤维化和心肌细胞凋亡。

PI3K-Akt通路是心肌细胞凋亡的重要通路，PIP3可以与下游的信号分子3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)及Akt结合转导信号。Akt(PKB)可被PDK1和PDK2磷酸化而激活，产生多种生物学效应，如促进葡萄糖转运体(GluT)1和4转位到细胞膜上，摄取葡萄糖，蛋白质合成，抑制细胞凋亡等。本研究说明雄激素可能有激活PI3K/Akt通路的作用。另外Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。Caspase-3最主要的底物与DNA修复、基因完整性监护有关，Caspase-3对于细胞的凋亡具有明显的促进作用〔18，19〕。本研究结果表明雄激素通过激活PI3K/Akt通路缓解心肌细胞凋亡从而改善心功能。免疫组化结果进一步表明雄激素可通过PI3K/Akt通路减少心肌细胞凋亡从而改善心功能。

目前超生理剂量下，雄激素可能有毒性作用，有研究〔20〕显示半胱氨酸T和司他诺佐洛尔可合成代谢型雄激素(AAS)，是一种具有类似T功能的合成物质。实验中使用了30只雌性瑞士老鼠。动物接受超生理剂量的AAS 30 d，两种AAS均显著改变心脏形态:丙酸T导致心室腔增大，司他诺佐洛尔增加左心室心肌厚度。总之，在超过生理剂量下使用AAS可改变心脏形态，可能严重影响健康。在生理水平上，T是安全的，并对心肌功能产生有益影响。多种激素和代谢紊乱与CHF的发展之间的联系已成为研究热点〔21〕，合成代谢力和分解代谢力的失衡可能是CHF发生的原因。激素替代治疗的有益影响有助于改善CHF的进程，雄激素可能在其中发挥重要作用。