不同蛋白水平日粮对荷斯坦公犊牛糖异生的影响

杨天宇 马晓宇 贡笑笑 彭 程 黄 杰 赵国琦,2,3 詹 康*

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.扬州大学 农业科技发展研究院，江苏 扬州 225009；3.扬州大学 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009)

犊牛时期是奶牛饲养过程中重要环节，犊牛生长性能受饲料成分和饲喂方式等多种因素的影响[1]。提供合理的日粮不仅可以提高饲粮的利用率，还可提高其成年后的总体发育水平。因此，犊牛培育是提高牛群品质和创建高产奶牛群的关键。以前奶牛营养研究关注点主要在泌乳奶牛，而近些年来，更多的研究集中在幼龄反刍动物营养方面[2]。

葡萄糖作为体内重要的营养单糖，是动物体内唯一可以通过血浆和细胞循环于全身的碳水化合物，参与多种细胞功能[3]。在反刍动物中，循环葡萄糖的90%～100%均来自糖异生。此外，调节反刍动物糖异生是改善动物健康、生长与生产性能的有效手段[3]。糖异生在犊牛生长发育发挥着至关重要的作用[4]。犊牛出生后经历的一个关键适应过程是：从子宫中葡萄糖、乳酸、氨基酸和脂肪酸获取能量，转变为依赖于乳糖、蛋白质和脂肪通过消化转变为葡萄糖、氨基酸和脂肪酸获取能量[5-6]。Elwyn等[7]研究表明，在消化蛋白的过程中，肝脏通过门静脉吸收多余氨基酸为糖异生储备糖原。与单胃动物不同，反刍动物从肠道中吸收的葡萄糖很少，都不同程度地依赖氨基酸作为糖异生底物产生葡萄糖。处于生长阶段的反刍动物需要大量的氨基酸通过糖异生途径合成葡萄糖[8]。此外，参与糖异生途径的关键限速酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)、丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)。提高肝糖异生与PCK和PC的表达增加有关[9-10]。此外，PC负责将线粒体中的丙酮酸转化为草酰乙酸，其启动子是通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC1A)的活化而被转录激活[11]；PGC1A可以调节关键的线粒体基因，这些基因有助于促进糖异生途径[12]。而FBP1酶催化果糖1,6-二磷酸转化为果糖6-磷酸。Wang等[13]研究表明，FBP1酶活性的降低会导致葡萄糖产量的下降。葡萄糖异生的最后一步，即G6PC酶催化葡萄糖6-磷酸，是葡萄糖从肝细胞释放的必要步骤[14]。

日粮中蛋白质是犊牛获取氨基酸最重要的途径。蛋白质是影响犊牛生长性能的重要因素。饲粮中蛋白质水平对反刍动物的生长性能、氮代谢、瘤胃发育有着促进作用[15]。前人研究表明日粮中蛋白水平在18%～21%可提高反刍动物的生长性能、采食量和蛋白利用率[16-17]。液体和固体是犊牛饲料两种形态。颗粒料既提供了均衡的营养成分，又可以直接进入瘤胃，促进瘤胃的发育[18]，同时也为成年时期提供了良好营养物质代谢的前提[19]。本课题组前期研究发现21.02%的蛋白水平更有利于5月龄公犊牛的生长发育[20]。

之前的研究均集中在不同蛋白水平对荷斯坦公犊牛生长性能的影响，而不同蛋白水平全价颗粒料能否对荷斯坦公犊牛糖异生途径产生影响？因此，本研究旨在探究不同蛋白水平全价颗粒日料对5～6月龄荷斯坦公犊牛糖异生影响，以为进一步探究高蛋白水平全价颗粒料对犊牛糖异生途径的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2017年4月—2017年6月在扬州大学农牧场进行，选择月平均月龄为5月龄，体重(172.80±7.16) kg 10头荷斯坦公犊牛(随机分为2组，每组5头。试验每组分别添加蛋白含量为15.05% 和21.02%的犊牛全价颗粒料，15.05%的犊牛全价颗粒料记为LP及21.02%的犊牛全价颗粒料记为HP组，自由饮水。按试验牛体重的3%进行饲喂。通过每周更改一次颗粒料的饲喂量，确保LP与HP组犊牛的干物质饲喂量基本一致。试验分为预试期和正试期，预试期7 d，正试期56 d。饲养试验结束后，将所有供试牛，在禁食(自由饮水)24 h后进行屠宰，收集3 g肝脏到2 mL离心管，迅速放入液氮中，回到实验室于-80 ℃冰箱冻存。

试验期间，日粮采用全价颗粒料，自由采食，营养需要参照NRC(2001)。全价颗粒营养成分见表1。

表1 全价颗粒料组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient level of whole grain (DM basis)

1.2 样本采集

在正试期第56 天，于晨饲5 h后，在犊牛颈部颈静脉使用真空采血管进行采血，采血量约为20 mL，在真空采血管中(无抗凝剂)转入5 mL血样，静置30 min，3 500 r/min 15 min离心，制备的血清样品于-80 ℃冰箱中保存。

试验结束后，共10头试验公犊牛，在禁食(自由饮水)24 h后进行屠宰，收集3 g肝脏，迅速放入液氮中，回到实验室放入-80 ℃冰箱冻存。

1.3 肝脏和血清中葡萄糖的测定

精确称取50 mg肝脏组织放入离心管后，加入250 μL裂解液，用电动匀浆器匀浆破碎组织，匀浆后室温静置10 min。取230 μL上清液转移至1.5 mL 离心管中，取剩下的裂解液用BCA法进行蛋白质量浓度测定。

制备好的血清样品和肝脏裂解液，采用葡萄糖试剂盒(购于北京普利莱基因技术有限公司)测定葡萄糖(GLU)。

1.4 肝脏中氨基酸测定

称取肉样70 mg，加500 μL 6 mol/L HCL，匀浆60 s。将其转移至20 mL安瓿瓶，2 mL 6 mol/L HCL清洗匀浆器，然后使用6 mol/L HCL定容至10 mL。放-20 ℃冰箱5 min，氮吹仪去掉空气，酒精喷灯封口。在110 ℃下水解24 h，1 h后摇动一次；24 h后拿出冷却至室温，全部转移至50 mL容量瓶，使用超纯水定容后摇匀。用0.22 mm水相滤膜过滤1 mL取500 μL至1.5 ml离心管中，氮吹仪吹干。200 μL 0.1 mol/L HCL 溶解，漩涡震荡。加20 μL 正亮AA,加100 μL三乙氨已膘溶液，加100 μL 衍生试剂c异硫睛酸苯芷，混匀，室温静置1 h。加正己烷400 μL，漩涡震荡，室温15 min。取下层液体，0.22 mm滤膜过滤后，取200 μL滤液+800 μL超纯水。最后取10 μL上样。谱柱：SunFireTM C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)装有SunFireTM C18保护住(4.6 mm×20 mm, 5 μm)；流动相A：0.1 mol/L醋酸钠乙腈溶液(93∶7)，pH 6.5；流动相B：乙腈-甲醇-超纯水溶液，比例为80∶10∶10；梯度洗脱，程序见表1，流速0.7 mL/min，柱温40 ℃，检测波长254 nm。测定肝脏中17种氨基酸。

1.5 肝脏总RNA提取和反转录成cDNA

称50 mg肝脏组织于1.5 mL离心管，按照总RNA提取试剂盒(Tiangen，中国)提取总RNA。最后，取1 μL提取的样品进行总RNA浓度和纯度的测定。按照Takara反转录试剂盒进行。反转录体系为10 μL，反应条件：37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s；PCR反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，每个样品都有3个重复。

1.6 Real-time PCR

荧光定量PCR反应配置总体系为20.0 μL，其中SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ Kit 10.0 μL；10 μmol/L 的PCR Forward primer和PCR Reverse Primer各0.8 μL；Water PCR grade 6.4 μL；cDNA 2.0 μL。引物详情见表2。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，每个样品都有3个重复。计算方法按照2-ΔΔCt。因为在奶牛中甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)基因稳定性高。因此，以GAPDH作为内参基因对糖异生关键的mRNA表达进行归一化处理。

表2 荧光定量PCR引物信息Table 2 Information of reverse-transcription PCR primers

1.7 数据统计分析

结果采用“平均数±标准误”表示。运用SPSS 16.0 统计软件中的独立样本t检验进行显著性检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示极显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白水平的日粮对犊牛血清和肝脏葡萄糖含量的影响

不同蛋白水平的日粮对犊牛血清和肝脏葡萄糖的含量，结果见表3。与低蛋白组相比，高蛋白组极显著提高(P<0.01)肝脏中的葡萄糖含量，同时也显著提高(P<0.05)血清中葡萄糖含量。

表3 不同蛋白水平饲料对犊牛血清和肝脏葡萄糖含量的影响Table 3 Effects of protein at different concentrations on glucose content in serum and liver of Holstein bull calves

2.2 不同蛋白水平的日粮对犊牛肝脏氨基酸含量的影响

采用液相色谱的方法检测犊牛肝脏中氨基酸的含量见表4。与低蛋白组相比，高蛋白组显著提高(P<0.05)Asp、Ala、Ser、Leu、Lys、Phe、Ile、Val、Tyr、Arg、Glu和His的含量，极显著提高(P<0.01)Gly和Pro的含量，但未改变Thr和Met的含量。

表4 不同蛋白水平饲料对犊牛肝脏氨基酸含量的影响Table 4 Effects of protein at different concentrations on amino acidscontent in liver of Holstein bull calves mg/g

2.3 不同蛋白水平的日粮对犊牛肝脏糖异生关键基因表达水平的影响

采用qRT-PCR分别检测PCK1、PCK2、PC、FBP1、G6PC和PGC1A在不同蛋白水平日料饲喂犊牛的肝脏中的表达变化(表5)。与高蛋白组相比，高蛋白组显著提高了(P<0.05)PCK2、PC和PGC1A基因表达量，极显著提高了(P<0.01)PCK1基因表达量，其他基因无显著差异。

表5 不同蛋白水平饲料对犊牛肝脏糖异生途径关键基因mRNA表达的影响Table 5 Effects of protein at different concentrations on mRNA expression of key genes of gluconeogenesis pathway in liver of male calves

3 讨论与结论

糖异生对犊牛生长发育起着重要的作用[4]。尤其在进食后，当代谢产物大量流入血液时，糖异生起着至关重要的角色[22]。通过氨基酸转成为葡萄糖是糖异生经典途径之一[23]。除了赖氨酸和亮氨酸外，其他的氨基酸都可以通过糖异生途径生成糖。在维持饲养水平的反刍动物中，内源性葡萄糖最少有15%是由氨基酸转化而来的，来自肝脏摄取的氨基酸占32%。在生长阶段的反刍动物，需要大量的氨基酸去合成葡萄糖维持生长发育[24]。而日粮中蛋白质是氨基酸的最重要来源。以往的研究主要集中在不同水平蛋白日粮对犊牛生长性能、血清生化和瘤胃发酵的影响，但不同水平蛋白日粮对犊牛糖异生的影响尚不清楚。因此本研究旨在不同蛋白水平全价颗粒日粮对犊牛糖异生的影响。

在正常饲养水平下，反刍动物血糖浓度总是维持在一定的恒定范围之内，这对维持机体各组织细胞的能耗和功能发挥着重要作用。外源葡萄糖的吸收和内源性糖异生作用都对血糖浓度有影响，而内源性糖异生作用主要来自肝糖异生[25]。本课题组前期研究表明[20]，高蛋白组会提高3 h血清中葡萄糖含量，但显著不差异。李辉等[26]研究表明，22%蛋白水平也可提高犊牛血糖含量。低蛋白组由于采食的日粮水平较低，犊牛对营养物质的消化吸收能力较差，难以提供足够的葡萄糖。本研究表明，日粮中高水平蛋白(21.02%)可以显著提高犊牛5 h血清葡萄糖和屠宰后肝脏葡萄糖含量。这可能是蛋白质消化为氨基酸在肝脏通过糖异生作用促进血糖提高的原因。但是关于犊牛的氨基酸肝脏糖异生研究很少有报道。肝脏是氨基酸主要代谢的场所。除了赖氨酸和亮氨酸外的18种常见氨基酸均可以通过糖异生途径生成葡萄糖。本研究中发现，除了苏氨酸和蛋氨酸以外，21.02%蛋白水平组增加了肝脏中其他氨基酸的含量。

糖异生途径包含4种关键的限速酶，即PC、PCK、FBP1和G6PC。草酰乙酸是由PC编码的酶催化线粒体中丙酮酸得来的，提供糖异生中间体补充所需的草酰乙酸。在糖异生作用的增加时候，PC的mRNA表达被促进以响应来自糖原性AA和乳酸的草酰乙酸[9]。本研究表明，与低蛋白组组相比，高蛋白组组可以显著提高PC的mRNA表达量。苹果酸是草酰乙酸在线粒体苹果酸脱氢酶的还原作用下生成的，并输出到细胞质中，并在细胞质中苹果酸脱氢酶氧化作用后再次生成草酰乙酸。PCK1和PCK2酶分别催化草酰乙酸在细胞质和线粒体中形成磷酸烯醇式丙酮酸。在细胞中，磷酸烯醇式丙酮酸是由PCK1催化草酰乙酸产生，这是糖异生的关键反应。本研究发现，高蛋白组可显著促进PCK1的mRNA表达量。先前的研究报道表明，氨基酸进入糖异生是由PC和PCK1编码的酶调节的，而不是PCK2，因为氨基酸形成磷酸烯醇式丙酮酸需要在胞浆中独立合成NADH[27]。PC和PCK1的 mRNA表达量的增加，进一步暗示了饲喂高蛋白可促进肝脏中磷酸烯醇式丙酮酸浓度增加，进而满足下一步糖异生反应。尽管以氨基酸作为前体物质的糖异生并不依赖PCK2，但是PCK2也在糖异生发挥着重要的作用。在单胃动物的肝脏中，PCK2只占总磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的大约1%～5%[28]，但在反刍动物中PCK1和PCK2的活性大致相等[10]。本研究发现，高蛋白组可显著促进PCK2的mRNA表达量。FBP1和G6PC的功能是催化果糖1,6-二磷酸转变为葡萄糖。尽管本研究显示，高蛋白组并未有显著的提高FBP1和G6PC的mRNA的表达量。先前的研究表明，高蛋白饮食增加了肝脏中PCK的活性，但对G6PC的活性影响不大[29-30]。PGC1A作为一种调节与能量代谢相关基因的转录辅激活物[31]。此外，PGC1A还参与糖异生关键基因的表达，通过提高PCK启动子的转录活性去提高肝脏中的PCK的表达水平。与低蛋白组相比，高蛋白组显著提高了PGC1A的mRNA表达量。此外，Dai等[32]研究发现高水平的氨基酸可以提高肝脏糖异生基因的表达和氨基酸的利用效率。本研究表明，日粮中高蛋白水平可以提高肝脏中氨基酸丰度同时增加肝脏糖异生关键基因的表达量，进而促进糖异生生成葡萄糖提供机体所需的能量。