谷子秸秆雨水淋溶物对其根围土壤细菌多样性的化感效应

冯茹姬 胡春艳 董淑琦 杨雪芳 郭振宇 原向阳 胡桃花 郭平毅

(1.山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；3.山西省晋中市气象局，山西 晋中 030600)

化感作用指活体植物、微生物向环境中释放的某种化学物质，对其他生物或自身生长发育产生的直接或间接的促进或者抑制作用[1]。化感效应存在于许多根系分泌物和植物残体腐解物中[2]。雨雾淋溶、自然挥发、根分泌和植株分解是植物化感物质释放到环境中的4种途径。从植株残体中得到的降水淋溶液可以显著抑制其他植物生长[3-4]，利用植物残体覆盖耕地能够有效地控制杂草[5]，都说明植株残体淋溶是化感物质释放的途径之一。

土壤微生物能反映土壤肥力和质量变化以及环境质量状况，其种群数量关系到有机质的分解和矿质元素的转化，影响作物的吸收和利用[6]。秸秆还田是秸秆综合利用最有效和最主要的途径，还田方式分为直接还田和间接还田[7]。不同秸秆还田方式对土壤理化性状的影响效果不同，对土壤微生物产生的影响不同：一方面秸秆还田通过影响土壤结构、土壤微气候(土壤水分、土壤温度等)和土壤养分，可显著影响土壤微生物群落结构和多样性[8-12]；另一方面秸秆还田为微生物提供丰富的能量和碳源，提高微生物的生物活性，为促进土壤有机质的分解和矿质元素的转化提供有力保障，如此往复形成良性的循环链，进而对后期作物健康生长及丰产有着积极的推动作用[13-17]。Li等[18]研究发现秸秆还田配施混合控释氮肥增加了参与纤维素和木质素降解的假单胞菌属、芽孢杆菌属和腐质霉属等细菌的丰度，加速了小麦灌浆期土壤的矿化和腐殖化过程，在实现作物增产的同时循环利用作物秸秆。张翰林等[19]研究发现秸秆还田处理提升了稻麦轮作土壤真菌群落多样性，但对细菌群落多样性无显著影响。韦安培[20]研究表明，秸秆还田显著改善了土壤理化性质，显著提高土壤微生物碳源代谢能力和代谢活性，最终显著增加了小麦产量。另外，周东兴等[21]研究发现，随着秸秆还田量的增加，秸秆腐解微生物群落碳源代谢活性、丰富度指数、优势度指数和均匀度指数均表现出先增加后降低的趋势。但是李涛等[22]的研究表明秸秆施入虽然提高了土壤微生物群落的生理代谢活性，但对微生物功能多样性指数没有显著性影响。近年来，对秸秆还田条件下土壤微生物进行的一些相关研究，主要集中在水稻、小麦和玉米等作物上[23-27]，对谷子的研究相对较少。因此，为了解秸秆覆盖化感物质对根围土壤细菌群落多样性的影响，本研究拟采用随机区组设计，在谷子株高达到20 cm后于垄间覆盖不同质量和长度的秸秆，灌浆期中雨后5 d采集根围土壤，利用16S rRNA扩增子测序技术，分析谷子秸秆雨水淋溶物对其根围土壤的细菌种群丰度和多样性的化感效应，以期为合理的秸秆覆盖还田技术推广应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于山西农业大学农作站(37°25′ N，112°34′ E)，海拔799.6 m。属于暖温带大陆性气候，年均日照时间为2 500～2 600 h，一年的有效积温约3 500～3 600 ℃，平均年降水量462.90 mm，每年的降水主要集中在7、8和9月。试验土壤类型为沙壤土，播前表层土壤各养分含量为：有机质8.52 g/kg，全氮1.22 g/kg，全磷0.76 g/kg，全钾19.36 g/kg，硝态氮64.20 mg/kg，有效磷43.70 mg/kg，速效钾484.20 mg/kg，pH 8.21。

1.2 试验设计

试验于2019年5月—10月在山西农业大学农作站试验田进行。试验品种为晋谷21号(山西省农科院经济作物研究所选育)，于2019年5月播种，播前撒施复合肥750 kg/hm2作为基肥，谷子生长期间不施肥，进行常规田间管理。在谷子出苗20 cm时，将供试秸秆均匀覆盖在对应区域行间。试验采用随机区组设计，设不同秸秆质量和不同秸秆长度2个因素，以不覆盖秸秆为对照，共7个处理组合，每处理重复3次，每小区面积为20 m2(4 m×5 m)。试验区组设计见表1。

表1 试验地秸秆覆盖方案Table 1 Straw mulching scheme of experimental

土样采集：于2019年谷子灌浆期中雨后5 d采用五点取样法采集0～5 cm谷子根围表层土壤，每小区重复3次，去除谷子根系、植株残体和石子等杂物，过1 mm土壤分样筛后混合均匀，放入冰盒带回实验室，保存至-80 ℃冰箱用于DNA提取等分子生物学分析。

1.3 试验方法

1.3.1DNA 抽提

土壤总DNA抽提使用E.Z.N.A.®soil试剂盒，DNA浓度和纯度利用NanoDrop 2 000进行检测，DNA提取质量利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压5 V/cm，时间20 min。

1.3.2PCR扩增

用特异性引物515F (5′-GTGYCAGCMGCC-GCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′)对细菌16S V4可变区进行PCR扩增。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min，35个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min。扩增反应体系为20 μL。

1.3.3PCR产物鉴定、纯化及定量

每个样本3个PCR重复，将3个重复的PCR产物混合，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行PCR产物纯化，Tris-HCl洗脱后使用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，再采用QuantusTMFluorometer对其进行检测定量。按照测序量要求，进行相应比例的混合后进行细菌多样性测定。

1.3.4高通量测序数据的分析

根据参考文献[28]、[29]和[30]的方法将测序序列结果进行质控后得到有效数据。利用Uparse软件、SILVA132的SSUrRNA数据库进行OTUs聚类和物种注释分析。以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，进行Alpha多样性分析和Beta多样性分析。

使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Chao1、Shannon、Simpson、ACE指数；使用Origin 2021绘制稀释曲线；使用R软件(Version 2.15.3)通过wilcox秩和检验分析Alpha多样性指数差异性；使用R软件的vegan软件包进行NMDS分析。

利用PICRUSt将细菌OTU丰度矩阵与KEGG数据库比对，获得菌群功能预测信息，用R软件绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌物种聚类分析

2.1.1不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌物种聚类最小操作单元(OTU)分析

将不同质量和长度的秸秆覆盖下的谷子根围土壤细菌的测序有效数据聚类，共得到9 480个OTUs。OTUs序列的注释结果中，能够注释到界水平的OTUs数目为8 212(占86.62%)，其中：门水平占74.56%；纲水平占66.18%；目水平占56.57%；科水平占46.37%；属水平占26.10%;仅有506个OTU注释到种水平。

土壤细菌物种花瓣图见图1。可知：7个处理共有的OTU数目为2 576，其中W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1、W3L3、CK特有的OTU数目分别为326、338、335、504、283、189及149，W2L3处理下较其他处理下的特异性细菌OTU数目最多。

花瓣图中每个花瓣代表一个处理，不同的颜色代表不同的处理。中间的Core数字代表的是所有处理共有的OTU数目，花瓣上的数字代表该处理特有的OTU数目。In the petal diagram, each petal represents one treatment, and different colors represent different treatments. The core number in the middle represents the number of OTUs common to all treatments, and the number on the petal represents the number of OTUs unique to this treatment.图1 土壤细菌物种花瓣图Fig.1 Petal diagram of soil bacterial species

2.1.2不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌群落组成分析

细菌门水平物种相对丰度的结果见图2。可知：相对丰度>1%的门类共有5门，分别是：变形杆菌门(Proteobacteria，占28.46%～36.36%)；酸杆菌门(Acidobacteria，占13.35%～18.48%)；放线杆菌门(Actinobacteria，占12.14%～14.01%)；芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，占10.67%～13.98%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，占7.81%～10.60%)。所有处理下土壤细菌在门水平物种组成的优势门相同，均为变形杆菌门、酸杆菌门、放线杆菌门和芽单胞菌门，但其相对丰度有差异(图2)。雨水淋溶不同质量和长度的谷子秸秆，土壤细菌酸杆菌门相对丰度与CK相比均有不同程度的增加，增加幅度为1.12%～6.25%；土壤芽单胞菌门相对丰度与CK相比均有不同程度的减少，减少范围为0.70%～3.10%，W2L3处理下变形杆菌门相对丰度比CK降低6.13%，放线杆菌门相对丰度比CK降低4.89%。

图2 土壤细菌门水平上的物种相对丰度图Fig.2 Relative abundance of soil bacterial community based on Phylum level

由细菌属水平物种相对丰度的结果可知：相对丰度>1%的属共有9属，分别是：鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas，占4.65%～7.63%)；目前纲科目未定的酸杆菌门(unidentified Acidobacteria，占2.66%～4.16%)；斯克尔曼氏菌属(Skermanella，占1.21%～1.63%)；乳杆菌属(Lactobacillus，占1.06%～2.58%)；黄色土源菌属(Flavisolibacter，占1.00%～1.95%)；芽单胞菌属(Gemmatimonas，占1.00%～1.68%)；马赛菌属(Massilia，占0.25%～1.11%)；Ramlibacter(占0.40%～1.03%)和溶杆菌属(Lysobacter，占0.49%～1.06%)。各处理下土壤细菌在属水平物种组成的优势属略有不同，为鞘氨醇单胞菌属、目前纲科目未定的酸杆菌门、乳杆菌属、黄色土源菌属、芽单胞菌属、斯克尔曼氏菌属中的4～6属，且优势属的相对丰度有较大差异，其中马赛菌属和Ramlibacter是CK处理下特有优势属，溶杆菌属是W1L3处理下特有优势属。W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1和W3L3处理较CK处理鞘氨醇单胞菌属相对丰度在5%显著水平下均显著下降，分别下降23.98%、39.06%、25.69%、32.24%、18.22%和20.58%；W1L3、W2L1、W3L1和W3L3处理下黄色土源菌属相对丰度在5%显著水平下较CK处理显著下降71.90%、30.16%、47.62%和59.79%；W1L3、W2L3和W3L3处理下芽单胞菌属相对丰度在5%显著水平下较CK处理显著下降45.24%、40.48%和10.71%。

2.2 不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌Alpha多样性分析

2.2.1不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌稀释曲线分析

不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌稀释曲线见图3。结果所示：不同质量和不同长度的秸秆覆盖下土壤细菌稀释曲线逐渐趋于平缓，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种(OTUs)，基本可以反映出不同秸秆覆盖处理下谷子根围土壤细菌变化趋势。随测序数量的增加，物种数量先是急剧增加，后变得渐进平缓，说明各秸秆覆盖处理下新的物种增加量已经很少，数据分析时均一化选取量(Cutoff=39 641)合理。测序条数在6 615以下时曲线急剧上升，各秸秆覆盖处理的稀释曲线基本重合，随测序条数不断增加，各秸秆覆盖处理的稀释曲线逐渐分离，其物种量的丰富程度出现差异，在测序条数达到26 430后，各秸秆覆盖处理的稀释曲线完全分离。6种秸秆覆盖处理下，根围土壤细菌物种量的丰富程度差异不明显，W2L1秸秆覆盖处理下土壤细菌物种量的丰富程度最高，对照(不覆盖秸秆)处理下土壤细菌物种量的丰富程度最低，不同秸秆覆盖处理下土壤细菌物种量的丰富程度由高到低的排列顺序为：W2L1>W1L3>W2L3>W3L1>W1L1>W3L3>CK。

注：稀释曲线中，横坐标为从某个处理中随机抽取的测序条数，纵坐标为基于该测序条数能构建的OTU数量，用来反映测序深度情况，不同的样本使用不同颜色的曲线表示。Note：In the dilution curve, the horizontal coordinate is the number of sequencing numbers randomly selected from one treatment, and the vertical coordinate is the number of OTUs that can be constructed based on the number of sequencing numbers to reflect the sequencing depth. Different treatments are represented by curves in different colors.图3 土壤细菌OTU稀释曲线Fig.3 Dilution curve of soil bacteria

2.2.2不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌Alpha多样性指数分析

不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌Alpha多样性指数组间差异箱型图见图4。由Alpha 多样性指数分析可知：不同质量和长度的谷子秸秆覆盖后谷子根围表层土壤细菌Alpha多样性指数均>CK，说明秸秆覆盖提高了谷子根围土壤细菌群落丰富度及多样性。反映群落丰富度的理论预估值(Chao1指数和ACE指数)在不同程度的受到秸秆雨水淋溶物质的影响，所有处理下ACE指数和Chao1指数的变化趋势一致，但差异并不显著，说明秸秆覆盖下谷子根围土壤细菌丰富度均有提高，且土壤细菌丰富度与秸秆覆盖量呈现正相性关系(图4)。结合土壤细菌属水平上的物种相对丰度数据可知，各处理在属水平群落均匀度增加，表现为相对丰度占比较高的纲科目未定的酸杆菌属、斯克尔曼氏菌属、乳杆菌属与CK相比丰度增加，而鞘氨醇单胞菌属、黄色土源菌属、芽单胞菌属与CK相比丰度减少。Shannon指数的各处理离散程度与CK相比均较小(图4)。在1 cm长度(L1)的谷子秸秆覆盖下，反映群落物种多样性的Shannon指数和Simpson指数随覆盖质量的增加而增加，但是在5 cm 长度(L3)的秸秆覆盖下，随覆盖质量的增加Shannon指数和Simpson指数先增加后减小。各处理的Shannon指数均>CK，但只有W1L3和W3L1处理与CK相比达到了差异显著或极显著水平；各处理间均未达到差异水平。W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1和W3L3的Simpson指数与CK相比均增加，但只有W1L3和W3L3处理与CK相比达到了差异显著或极显著水平；W2L3处理与W1L3、W3L3处理分别差异显著或极显著(图4)。

图4 Alpha多样性指数组间差异箱型图Fig.4 Box graph of Alpha diversity index between different group

2.3 不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌Beta多样性分析

经NMDS分析可知：不同质量和长度的秸秆覆盖下土壤细菌群落NMDS分析的应力值为0.102，拟合水平较理想，可以准确反映不同质量和长度的秸秆覆盖下土壤细菌群落间的差异程度。不同质量和长度的秸秆覆盖下的土壤样本大体聚类为3组：W1L3、W2L3、W3L3 3种秸秆覆盖量处理聚类在一起；W1L1、W2L1、W3L1 3种秸秆覆盖量处理聚类在一起；CK单独聚类，反映了不同质量和长度的秸秆雨水淋溶物对土壤细菌群落结构具有明显的影响。从图中各处理样品点的相对位置可以看出W1L3、W2L3、W3L3的细菌物种组成更为相似且均距离CK较远，说明不同秸秆长度和质量覆盖还田后，W1L3、W2L3、W3L3处理与其他处理已明显分开，细菌物种组成已出现差异；但其他处理仍有交叉，细菌物种组成差异不明显。

2.4 不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌群落PICRUSt功能预测

2.4.1功能基因家族组成

将预测得到的功能基因家族与KEGG数据库比对发现，第一等级上，所有菌群的基因序列注释到的功能可分为6类，其中前3类分别是：新陈代谢、遗传信息加工和环境信息加工。第二等级上，参与新陈代谢的菌群中，以参与碳水化物代谢、氨基酸代谢和能量代谢的为最大类群；参与遗传信息加工的菌群中，参与翻译类群具有明显优势，其次是复制和修复的类群；参与环境信息加工的菌群中，参与膜转运和信号转导的类群具有明显优势。

2.4.2代谢相关基因分析

对不同质量和长度的秸秆覆盖下的土壤样品的KEGG直系同源基因簇(KEGG orthologous groups)丰度热图(图5)分析发现，碳水化物代谢、氨基酸代谢和能量代谢通路上的相关基因表达差异较为显著；各土壤样品可大致聚为W3L1、W3L3、CK和W1L1、W1L3、W2L1、W2L3 2类，秸秆化感物质明显降低代谢相关基因丰度，其中W2L1秸秆覆盖处理下代谢相关基因丰度与其他6个处理具有明显劣势。对该处理下劣势基因所对应的酶进行筛选并归类，得到：与脂肪酸合成代谢相关的酰基载体蛋白还原酶(K00059)，与能源物质代谢相关的重要中间代谢物乙酰CoA(K00626)，具有特异催化蛋白质底物功能(丝氨酸、苏氨酸羟基磷酸化)的蛋白激酶(K08884)，作用于支链氨基酸(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)转运系统中的酶(K01955、K00265、K01915)，参与肽/镍转运系统底物结合和渗透的酶蛋白(K02035)，参与蛋白质及氨基酸代谢相关蛋白(K00548)。

KEGG直系同源基因簇(KO)丰度热图中，横坐标表示所测土壤样本,纵坐标表示代谢相关基因所对应的酶。In the abundance heatmap of KEGG orthologous groups (KO) cluster, the horizontal coordinate represents the soil samples tested, and the vertical coordinate represents enzymes corresponding to metabolism-related genes.图5 不同土壤样本细菌群落KEGG直系同源基因簇(KO)丰度热图Fig.5 Abundance heatmap of KEGG orthologous groups (KO) cluster for different soil samples bacterial community

3 讨 论

3.1 秸秆化感物质对谷子根围表层土壤细菌群落组成及多样性的影响

作为农田生态系统的重要组成部分，土壤微生物在土壤有机质形成和转化、土壤养分循环等方面发挥着至关重要的作用[31]。同时，土壤微生物群落组成及活性变化是衡量土壤质量和其生态系统功能的关键性指标之一[32]。秸秆中的营养物质可在还田后为土壤微生物提供丰富的营养物质，提高群落多样性和丰富度以及土壤微生物代谢能力[33]。沈晓琳等[34]的研究表明，秸秆还田提高了土壤团聚体细菌和真菌生物量，改善了土壤团聚体微生物群落结构，增加了土壤固碳能力和保持土壤微生物多样性。本研究中各样品中细菌群落共有的OTUs种类占自身比例较小，特有的OTUs种类较多。物种注释结果表明：所有处理下土壤细菌在门水平物种组成的优势门相同，均为变形杆菌门、酸杆菌门、放线杆菌门和芽单胞菌门，但相对丰度有差异。雨水淋溶不同质量和长度的谷子秸秆，增加了土壤细菌酸杆菌门的相对丰度，减少了土壤芽单胞菌门的相对丰度。不同秸秆覆盖处理下，谷子根围土壤细菌群落内的丰富度分析中，土壤细菌丰富度指数的分析表明秸秆覆盖处理为W1L3和W2L3时能让细菌的丰富度维持在较高水平。秸秆还田不仅为土壤提供营养物质，供给植物和微生物生长，同时秸秆在雨水淋溶之后化感物质渗入地表，低浓度的化感物质能促进微生物的生长发育和繁殖，高浓度的化感物质抑制微生物的生长发育和繁殖，导致微生物群落丰富度下降。从土壤细菌群落间多样性分析来看，相比无秸秆覆盖处理下，在秸秆覆盖量为W1L3及W2L1处理下细菌群落多样性较高，土壤细菌多样性明显提高，秸秆覆盖量小，雨水淋溶化感物质少，促进了土壤细菌多样性。不同质量和长度的谷子秸秆覆盖下其根围土壤细菌群落结构图和NMDS分析都表明W1L3和W3L1秸秆覆盖处理时土壤细菌群落组成优势属差异较大，但其群落结构较其他秸秆覆盖处理更加稳定。因此，W1L3和W3L1秸秆覆盖处理更有利于提高细菌群落的多样性和维持细菌群落的均匀度和稳定性。综合群落内和群落间的分析，当秸秆覆盖量为W1L3和W3L1秸秆覆盖处理时，秸秆雨水淋溶物化感作用促进土壤细菌群落丰富度较高，细菌的多样性较高和均匀度较好且群落比较稳定。

3.2 功能预测

KEGG丰度热图的初步分析发现W2L1秸秆覆盖处理的多种与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢的酶基因相对丰度具有明显劣势。酰基载体蛋白还原酶能从头合成脂肪酸[35]。乙酰CoA是代谢过程中的一个关键节点，与许多代谢途径和转化相互交叉[36]。这些功能酶在土壤细菌中存在，使得土壤中碳水化合物的代谢和脂类代谢得到促进。本研究中上述酶基因丰度较不覆盖秸秆处理明显减少，表明在W2L1处理产生的秸秆淋溶物减少了土壤中与碳代谢有关的细菌类群，抑制了碳源利用能力。氨基酸作为土壤微生物的优良碳源和氮源[37]，能促进土壤微生物活动，增加土壤微生物数量[38]。氨基酸的合成是碳代谢与氮代谢的枢纽[39]。本研究表明，W2L1处理产生的秸秆淋溶物减少了土壤中与碳代谢及氮代谢相关细菌，抑制土壤碳、氮代谢。此外，镍元素能促进氮素转运，参与尿素的水解过程，缺乏镍元素会导致植物体内尿素的积累[40-42]，钛元素可以增加叶绿素含量、提高光合效率，增强植物细胞活力[39]。本研究表明，W2L1处理产生的秸秆淋溶物与CK相比降低了钛、镍元素转运相关的酶基因丰度，抑制了土壤中微量元素钛和有益元素镍的利用。

4 结 论

谷子秸秆的雨水淋溶物可以改善土壤细菌群落结构，提高其群落多样性，尤以W1L3(2 000 kg/hm2秸秆覆盖量、铡切长度5 cm)处理产生的雨水淋溶物化感促进效果较好，且W3L1(4 000 kg/hm2秸秆覆盖量、铡切长度1 cm)处理产生的秸秆淋溶物对碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢通路上的相关基因表达的化感抑制效果较为显著。