金露梅黄酮提取工艺的响应面优化及其抗氧化和降血糖活性分析

薛鹤　曾阳　李锦萍　左文明　刘力宽

摘要：【目的】優化金露梅中黄酮的超声提取工艺条件，检测黄酮化合物的种类及含量，并分析其抗氧化和降血糖活性，为金露梅的综合利用提供技术支持。【方法】以总黄酮提取率为指标，采用单因素和响应面分析法对超声提取金露梅黄酮的主要工艺参数进行优化分析，利用多重层析柱对黄酮化合物进行分离纯化，并比较各组分的抗氧化和降血糖活性。【结果】4个因素对金露梅总黄酮提取率影响的显著性顺序为液料比>超声时间>乙醇体积分数>超声功率，建立的回归方程为Y=37.84+14.48A+14.93B+3.02C+9.38D-0.03AB-0.66AC-0.01AD-0.01BD-0.01CD-14.71A²-11.25B²-16.96C²-12.89D²（Y表示总黄酮提取率，A、B、C、D分别表示液料比、乙醇体积分数、超声功率和超声时间）;超声提取金露梅黄酮的最佳工艺条件为：液料比39.78∶1（mL/g）、乙醇体积分数65.47%、超声功率390.98 W、超声时间49.55 min，在此条件下金露梅总黄酮提取率为47.59 mg/g。金露梅黄酮化合物中发现含有8种化合物，其中含量最高的为槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（10.90 mg/g）。柚皮素对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率最低，仅为5.0%，其余7种化合物对DPPH自由基的清除率均达50.0%以上，表现出良好的抗氧化活性。金露梅黄酮化合物对葡萄糖消耗率均高于二甲基亚砜（DMSO），其中（+）-儿茶素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和3-阿拉伯葡萄糖基槲皮素对葡萄糖的消耗率达19.5%以上，表现出良好的降血糖活性。【结论】经响应面优化的金露梅黄酮超声提取工艺切实可行，建立的回归方程具有较高的准确性;多重层析柱法可实现金露梅中黄酮化合物的分离纯化，各组分除柚皮素外，均具有明显的抗氧化活性，且各组分化合物均有一定的降血糖活性。金露梅可作为一种天然抗氧化剂和降血糖剂来源在食品、医药等方面进行开发利用。

关键词： 金露梅;黄酮;响应面分析;超声提取;抗氧性活性;降血糖活性

中图分类号： S567.239;TS201.2               文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）02-0505-11

Optimization for extraction process of flavonoids from Potentilla fruticosa L. by response surface method and the analysis of its antioxidant and hypoglycemic activities

XUE He ZENG Yang LI Jin-ping ZUO Wen-ming LIU Li-kuan

（1College of Life Science， Qinghai Normal University， Xining  810008， China; 2Academy of Plateau Science and Sustainable Development， Xining  810008， China）

Abstract：【Objective】The ultrasonic extraction conditions of flavonoids from Potentilla fruticosa L. were optimized，the types and contents of flavonoids were detected，and their antioxidant and hypoglycemic capacities were analyzed，in order to provide technical support for comprehensive utilization of P. fruticosa L. 【Method】The single factor method and the response surface methodology（RSM） were employed to optimize the main parameters of ultrasonic extraction of flavonoids from P. fruticosa L.， with extraction yield as the index. Multiple chromatographic columns were used for the separation and purification of the flavonoid compounds，and the antioxidant capacity and hypoglycemic capacity of these compounds were compared. 【Result】The significant order of the four factors on the extraction yield of flavonoids was as follows：solvent/solid ratio>ultrasonic time>volume fraction of ethanol>ultrasonic power. The regression equation established was as follows：Y=37.84+14.48A+14.93B+3.02C+9.38D-0.03AB-0.66AC-0.01AD-0.01BD-0.01CD-14.71A²-11.25B²-16.96C²-12.89D²（Y represented extraction rate of flavonoids;A，B，C and D represented liquid-solid ratio，ethanol vo-lume fraction，ultrasonic power and ultrasonic time，respectively）. The optimal extraction conditions were as follows：liquid-solid ratio of 39.78∶1（mL/g），ethanol volume fraction of 65.47%，ultrasonic power of 390.98 W and ultrasonic time of 49.55 min. Under these conditions，the extraction yield of flavonoids was 47.59 mg/g. Eight flavonoids were found in the extract of P. fruticosa L.，among which the most abundant was quercetin-7-O-β-D-glucuronide （10.90 mg/g）. Naringenin had the lowest scavenging yield of DPPH free radical， which was only 5.0%，while the scavenging yields of seven other compounds were greater than 50.0%，indicating good antioxidant activities. The glucose consumption yield of flavonoid compounds in P. fruticosa L. were higher than that of DMSO， and the glucose consumption yields of （+）-catechin，quercetin-3-O-β-D-glucuronide and quercetin-3-vicianoside reached more than 19.5%， suggesting their good hypoglycemic activities. 【Conclusion】The optimized ultrasonic extraction process of flavonoids by RSM is feasible and the established regression equation has high accuracy. The multiple chromatographic columns can be used for the separation and purification of the flavonoids in P. fruticosa L. All components except naringenin have obvious antioxidant activity，and all components have a certain hypoglycemic activity. P. fruticosa L. can be developed as a natural source of antioxidants and hypoglycemic agents in food，medicine and other fields.

Key words： Potentilla fruticosa L.; flavonoids; response surface methodology; ultrasonic extraction; antioxidant capacity; hypoglycemic capacity

Foundation items： Qinghai Scientific and Technological Achievement Transformation Project （2018-SF-144）;Qinghai Key Laboratory of Medicinal Plant and Animal Resources（2020-ZJ-Y40）; Qinghai Science and Technology Innovation Team Project（2020-2023）

0 引言

【研究意义】金露梅（Potentilla fruticosa L.）又名金老梅、药王茶和金腊梅，属蔷薇科萎陵菜属，是我国高寒地区的一种典型性落叶灌丛。其叶和花均可入药，具有清暑热、益脑清心、调经、健胃等功效（何佳亮等，2014;李晓雯和王春丽，2020）。金露梅的生物活性源于其含有多种黄酮类、萜类和鞣质类化合物，其中黄酮类化合物是金露梅中最典型的物质（罗梓文，2015）。黄酮苷原主要包括芹菜素、槲皮素、山奈酚、木犀草素、鼠李素、异鼠李素和杨梅素等，具有降血压、降血脂、降血糖和抗氧化等作用（王彦兵等，2020;孙美玲等，2021）。目前对金露梅的开发利用尚不充分，对其研究大多停留在种质资源分布方面，因此，加强金露梅有效物质的提取、纯化和功效研究，有助于提高西部地区对其综合开发利用的程度，具有显著的潜在经济价值。【前人研究进展】一些学者对金露梅的生物活性进行了研究。孙玉侠等（2016）研究发现金露梅总黄酮抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用强于阿卡波糖，高、低剂量总黄酮均能提高小鼠的糖耐量，揭示了金露梅总黄酮对α-葡萄糖苷酶和醛糖还原酶具有抑制活性;皮立等（2019）对青海省不同生态区野生金露梅叶生物活性成分进行分析和评价，发现不同地区金露梅叶的成分含量均存在显著差异，筛选出总黄酮、儿茶素、维生素C和蛋白质4个指标代表金露梅叶的品质，认为金露梅叶的生物活性成分含量较高，值得进一步深入研究和开发;李成慧（2020）采用层析柱、高效液相色谱和BUCHI快速纯化系统等方法富集制备金露梅中3种具有降糖活性的化合物，并测定其对α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性;李彩明等（2021）研究发现金露梅花茶、绿茶和红茶均具有调节高脂血症大鼠血脂及其肠道菌群谱的作用，推测金露梅茶可能经肠道菌群干预脂质代谢途径发挥降血脂的功效。在有效物质提取方面，超声提取法是一种更安全、廉价、环保和简便的技术，得到了广泛应用（Aryanti et al.，2017）。符群等（2018）利用减压—超声辅助醇法從薇菜中提取黄酮，获得最佳提取工艺条件，并对提取的黄酮抗氧化活性进行研究;张杨洋等（2020）利用超声辅助酶法提取银杏叶中的总黄酮，通过单因素和正交试验研究料液比、酶添加量、超声温度、超声时间和乙醇体积分数对银杏叶黄酮提取率的影响。在黄酮物质的分离纯化方面，毛迪锐等（2016）利用XAD-1600大孔树脂对文冠果壳总黄酮进行分离纯化，获得最佳分离工艺参数，纯化后总黄酮的纯度达70%以上，回收率达89.63%;张美荣等（2020）采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及制备型高效液相色谱对藏药镰荚棘豆中的黄酮类成分进行分离纯化，从其乙酸乙酯萃取部位中分离出16种黄酮化合物。【本研究切入点】尽管超声提取法已广泛应用，但针对不同提取对象时的工艺参数不尽相同，且在分离提纯方面提取对象和所含有效物质不同，分离纯化的具体方式也差异明显;目前针对金露梅有效物质超声提取方面的研究较少，也鲜有关于金露梅中黄酮类物质分离纯化及生物活性方面的研究报道。【拟解决的关键问题】对金露梅中黄酮类物质进行超声提取，研究液料比、超声功率、超声时间和乙醇体积分数对黄酮类物质提取率的影响，利用响应面法优化提取工艺;并采用多重系列柱层析法对金露梅黄酮化合物进行分离纯化，测定分析其种类和含量，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）分析法评定分离出的黄酮类化合物的抗氧化活性，同时对黄酮提取物的降血糖活性进行测试，为金露梅黄酮提取和高价值利用提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

金露梅采自青海省大通达坂山（东经101°50′32″，北纬37°8′42″，海拔3006 m），将其茎叶放入40 ℃干燥箱烘干至水分含量≤3%，再用高速粉碎机粉碎，过80目筛后备用。DPPH、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、H₃PO₄、NaNO₂、NaOH和Al（NO₃）₃均为分析纯;芦丁标准品（纯度99%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司;3T3-L1细胞、胰岛素和葡萄糖购自武汉益普生物科技有限公司;Intersil ODS-3 C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）购自日本岛津公司;Sephadex LH-20层析柱（25～100 μm）、MCI-gel CHP-20P层析柱（75～150 μm）和Diaion HP20SS层析柱购自日本三菱化学公司;硅胶H层析柱（200～300目）购自青岛海浪化工有限公司;葡萄糖（GO）检测试剂盒购自上海沪峥生物科技有限公司。

主要仪器设备：NAI-CS超声波细胞破碎仪（上海那艾精密仪器有限公司）;EVO18扫描电镜（德国蔡司）;TG16MW台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）;SHB-IIIG循环水式多用真空泵、干燥箱（郑州长城科工贸有限公司）;UH4150型紫外分光光度计（日立公司）;ME4002分析天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司];Agilent1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;恒温水浴箱（上海比郎仪器制造有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 金露梅黄酮超声提取 精确称量干燥的金露梅粉末40 g，按照一定液料比添加到特定体积分数的乙醇溶液中，设置超声功率和超声时间，对金露梅粉末进行乙醇超声提取，将提取后的溶剂放入高速离心机中，8000 r/min离心30 min，取上清液，并用与超声提取时相同体积分数的乙醇溶液冲洗下部沉积物，然后在真空抽滤机上用0.5 μm微孔膜负压抽滤，滤液与离心上清液合并，用真空旋蒸仪蒸干乙醇和水分，获得金露梅提取物浸膏，浸膏低温干燥后称重，计算金露梅提取物质量。

金露梅超声提取单因素试验中液料比（mL/g，下同）、乙醇体积分数、超声功率和超声时间4个提取工艺参量如表1所示。

1. 2. 2 提取工艺的响应面优化设计 在单因素试验基础上，以总黄酮提取率为响应值，对液料比、乙醇体积分数、超声功率和超声时间4个影响因素设计Plackett-Burman试验，因素水平和编码见表2。采用Box-Benhnken Design（BBD）设计试验对金露梅黄酮提取工艺参量进行响应面优化分析。

1. 2. 3 标准曲线绘制 采用NaNO₂-Al（NO₃）₃-NaOH比色法测定。称取13.2 mg芦丁标准品，用60%乙醇溶液定容至25 mL，制成标准溶液，吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mL芦丁标准溶液置于10 mL容量瓶中，分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4和0 mL 60%乙醇溶液，再加入0.5 mL 5% NaNO₂溶液，摇匀静置6 min，之后加入0.5 mL 10% Al（NO₃）₃溶液，静置6 min，最后加入4 mL 4% NaOH溶液，用60%乙醇定容，摇匀后静置15 min。在510 nm处测定吸光值，以芦丁质量浓度（mg/mL）作X轴，该浓度下的吸光值作Y軸，绘制标准曲线，拟合的芦丁标准曲线方程为Y=35.324X-0.0238，R²=0.9999。

1. 2. 4 金露梅提取物中总黄酮含量测定 以芦丁标准曲线为对照，测定金露梅提取物中总黄酮含量。称取一定质量的金露梅提取物，用60%乙醇定容至25 mL，按照1.2.3的方法处理后，在510 nm处测定吸光值。通过芦丁标准曲线方程，计算出测定样品中的总黄酮含量，再根据稀释倍数和提取物得率计算金露梅物料的总黄酮提取率。

C=A×N×m/M×m1 （1）

式中，C为金露梅中总黄酮提取率（mg/g），A为测定样品中的总黄酮含量（mg），N为稀释倍数，m为金露梅提取物总质量（mg），M为金露梅物料总质量（g），m1为测定样品中金露梅提取物质量（mg）。

1. 2. 5 金露梅中黄酮化合物组分测定 将提取的金露梅浸膏称量后悬浮于水中，用石油醚、乙酸乙酯依次萃取，获得石油醚层、乙酸乙酯层和水层;先将水层经Diaion HP20SS柱层析（甲醇—水梯度洗脱，体积比0∶1～1∶0，10%体积分数递增）脱糖去除色素，再将水层和乙酸乙酯层分别经Sephadex LH-20柱层析（甲醇—水梯度洗脱，体积比0∶1～1∶0，10%体积分数递增）、MCI-gel CHP-20P柱层析（甲醇—水梯度洗脱，体积比0∶1～1∶0，10%体积分数递增）、硅胶H柱层析（氯仿—甲醇—水洗脱，体积比7∶3∶0.5），通过反复的层析纯化分离化合物单体。

采用Agilent1200型高效液相色谱仪对分离的化合物与常见的黄酮化合物标品进行色谱比对分析，筛选获得金露梅中的黄酮化合物。色谱条件：色谱柱Intersil ODS-3 C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.2% H₃PO₄水溶液（体积比55∶45），流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长360 nm，进样20 μL。

1. 2. 6 金露梅黄酮化合物的抗氧化活性和降血糖活性试验

1. 2. 6. 1 DPPH分析法抗氧化活性试验 参考Kosani?等（2011）的方法进行。精确称量3.0 mg金露梅黄酮化合物，用60%乙醇溶液溶解并定容至25 mL，制得样品溶液;分别量取各样品溶液1.5 mL置于试管内，再分别加入4.5 mL 0.1045 mol/mL DPPH溶液，室温避光反应30 min，以无水乙醇作空白试验，在517 nm波长处分别测定吸光值。金露梅黄酮化合物的抗氧化活性按照公式（2）计算：

C=A0-（AS-AC）/A0 ×100 （2）

式中，C为DPPH自由基清除率（%），A₀为1.5 mL去离子水+4.5 mL DPPH溶液吸光值，A_s为1.5 mL样品溶液+4.5 mL DPPH溶液吸光值，A_c为1.5 mL样品溶液+4.5 mL无水乙醇吸光值。

1. 2. 6. 2 降血糖活性试验 将水浴解冻后的3T3-L1细胞经离心处理后，吹打均匀加入到盛有新鲜、完全培养基的培养皿中，在37 ℃、5% CO₂培养箱中进行培养，培养液隔天更换一次;待细胞长至对数期时进行传代。传代细胞长满后，将3T3-L1前脂肪细胞以10⁵个/mL密度接种至24孔板，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养至细胞完全融合后进行诱导分化。诱导分化的具体方法：加入诱导剂I（含10 μg/mL胰岛素、1 μmol/L Dex、0.5 mmol/L IBMX的完全培养基）培养48 h，再换成诱导剂Ⅱ（只含10 μg/mL胰岛素的完全培养基）培养48 h，然后每隔1～2 d更换一次完全培养基继续培养，分化至第8 d时，用1800 mg/L葡萄糖清洗细胞后，加入到200 μL低糖培养基中孵育，待测样品组用25 μmol/L浓度黄酮提取物孵育，对照组分别用DMSO和100 nmol/L胰岛素孵育，每个样品设3个重复孔。孵育24 h后吸取10 μL细胞培养基，用葡萄糖氧化酶—过氧化物酶法（陈启华等，2019）测定培养液中葡萄糖浓度。计算公式如下：

C=A_样×C_校/A_标（3）

式中，C为葡萄糖浓度（mmol/L），A_样为待测样品吸光值，C_校为校准品浓度（mmol/L），A_标为标准品吸光值。

葡萄糖消耗率根据公式（4）计算：

P=C_初-C_测C/_初×100 （4）

式中，P为葡萄糖消耗率（%），C_初为初始葡萄糖浓度，C_测为试验孔葡萄糖浓度。

1. 3 统计分析

采用Excel 2016整理数据并进行单因素方差分析，Design Expert 10进行响应面分析，以Origin 8.5制图。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 液料比对金露梅总黄酮提取率的影响 在乙醇体积分数60%、超声功率350 W、超声时间40 min的条件下，液料比对金露梅总黄酮提取率的影响如图1所示，在10∶1～40∶1范围内，随着液料比增加，总黄酮提取率显著提高（P<0.05，下同），当液料比为40∶1时，总黄酮提取率达45.64 mg/g，继续增大液料比，总黄酮提取率无显著变化（P>0.05，下同）。

2. 1. 2 乙醇体积分数对金露梅总黄酮提取率的影响 在液料比20∶1、超声功率350 W、超声时间40 min的条件下，乙醇体积分数对金露梅总黄酮提取率的影响如图2所示，在30%～60%范围内，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率显著提高，当乙醇体积分数为60%时，总黄酮提取率达最大值（31.62 mg/g），继续增大乙醇体积分数，总黄酮提取率则降低，但变化不显著。

2. 1. 3 超声功率对金露梅总黄酮提取率的影响

在液料比30∶1、乙醇体积分数60%、超声时间40 min的条件下，超声功率对金露梅总黄酮提取率的影响如图3所示，随着超声功率的增加，总黄酮提取率呈先升高后降低的变化趋势，当超声功率为350 W时，总黄酮提取率达最大值（42.52 mg/g）。单因素显著性方差分析结果显示，250和550 W超声功率对金露梅总黄酮提取率影响的差异未达显著水平，其余超声功率对金露梅总黄酮提取率的影响差异均达显著水平。

图4为金露梅粉末颗粒在经350 W超声波辐射振荡40 min前后的形貌，从图中可看出，原始的金露梅粉末颗粒形状规则，表面光滑平整，而经超声处理后，粉末颗粒形状不规则变形，表面变得粗糙不平，可观察到颗粒表面出现破损。

2. 1. 4 超声时间对金露梅总黄酮提取率的影响

在液料比30∶1、乙醇体积分数60%、超声功率350 W的条件下，超声时间对金露梅总黄酮提取率的影响如图5所示，在20～40 min范围内，随着超声时间的延长，总黄酮提取率显著提高，当超声时间为40 min时，总黄酮提取率为42.52 mg/g，继续延长超声时间，总黄酮提取率增加不显著。

2. 2 响应面法优化提取工艺分析结果

采用Design Expert 10对Plackett-Burman试验数据（表3）进行多元回归分析，得到金露梅总黄酮提取率为响应值的最优方程：Y=29.71+7.23A+1.68B+1.47C+4.36D。对影响金露梅总黄酮提取率的4个因素进行显著性分析，结果显示，液料比、乙醇体积分数、超声功率和超声时间4个因素的显著性P值均小于0.01，表明4个因素对金露梅总黄酮提取率的影响均达极显著水平（P<0.01，下同），其显著性排序为A（液料比）>D（超声时间）>B（乙醇体积分数）>C（超声功率）。

根据Plackett-Burman試验结果，按照4因素3水平设计Box-Benhnken Design（BBD）试验（表4），并采用Design Expert 10对试验数据进行响应面优化分析，得出预测的总黄酮提取率Y可用二次多项式表示：

Y=37.84+14.48A+14.93B+3.02C+9.38D-0.03AB-0.66AC-0.01AD-0.01BD-0.01CD-14.71A²-11.25B²-16.96C²-12.89D²

图6为液料比、乙醇体积分数、超声功率和超声时间两两因素间交互作用对金露梅总黄酮提取率影响的响应面，曲线走势越陡峭，说明该因素影响越显著，等高线越呈椭圆形，表明两因素的交互作用越显著。从图6可看出，液料比与乙醇体积分数的响应曲线最陡峭，表明两者对金露梅总黄酮提取率的影响最显著，其次是液料比与超声时间，以及乙醇体积分数与超声时间，而超声功率与乙醇体积分数的等高线椭圆形最明显，表明两者间的交互作用最显著。总黄酮提取率随液料比先增大，在达到最高点后基本保持稳定，随乙醇体积分数和超声功率增加先增大后减小，超声功率较低时，总黄酮提取率随超声时间延长而增加，但超声功率增大到一定程度后，总黄酮提取率随超声时间延长而先增大后减小，模拟的结果与单因素试验结果基本一致。拟合回归方程中得到最优的提取条件为：液料比39.78∶1、乙醇体积分数65.47%、超声功率390.98 W、超声时间49.55 min，预测的金露梅总黄酮提取率为47.59 mg/g。为了检查计算的最优参数，以液料比39.8∶1、乙醇体积分数65.5%、超声功率390 W、超声时间49.6 min为参数进行单次的验证试验，试验得到的总黄酮提取率为46.95±0.06 mg/g，与预测值之间仅存在微小的差别，表明模型对于从金露梅中提取总黄酮的预测精确。

2. 3 金露梅黄酮化合物组分分析结果

将上述最佳提取工艺获得的金露梅总黄酮提取物通过多重柱层析分离后，参考文献报道（Shaker et al.，2015;郑聪聪等，2015;Ma et al.，2016;Zhong et al.，2016;孙玉侠，2017），利用高效液相色谱仪进行黄酮化合物组分的测定。从图7可看出，提取的金露梅黄酮中含有8种化合物组分，分别为（+）-儿茶素-7-O-葡萄糖苷、（+）-儿茶素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸、3-阿拉伯葡萄糖基槲皮素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、槲皮素、柚皮素和圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷，其中含量最高的为槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸，达10.90 mg/g，其次为（+）-儿茶素-7-O-葡萄糖苷，达9.39 mg/g，而柚皮素含量最低，仅为0.51 mg/g。

2. 4 金露梅黄酮化合物抗氧化活性和降血糖活性分析结果

DPPH分析法是一种广泛采用的筛选自由基清除剂方法（羌宇等，2019），采用DPPH法对金露梅中的黄酮化合物进行抗氧化活性测试，并以DMSO和胰岛素为对照品，对黄酮化合物进行降血糖活性测试，结果如图8所示。金露梅的黄酮化合物中，柚皮素对DPPH自由基的清除率最低，仅为5.0%，其余7种化合物对DPPH自由基的清除率均达50.0%以上，表现出良好的抗氧化活性，其中槲皮素对DPPH自由基的清除率最高，为58.4%。金露梅中黃酮化合物对葡萄糖消耗率均高于DMSO，其中（+）-儿茶素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和3-阿拉伯葡萄糖基槲皮素对葡萄糖的消耗率达19.5%以上，接近胰岛素的2/3，表现出良好的降血糖活性，具有促进脂肪细胞摄取葡萄糖的能力。

3 讨论

在单因素试验的方差显著性差异分析中，液料比、乙醇体积分数、超声功率和超声时间的P值分别为3.62E-10、4.91E-07、1.3E-07和1.02E-07，均远小于0.01，且其检验统计量F值分别为273.604、62.45、82.347和86.549，均大于检验临界值Fcrit=3.47805，说明在检验水平为0.05的情况下，液料比、乙醇体积分数、超声功率和超声时间4个工艺参量对金露梅总黄酮提取率影响的差异均达极显著水平。金露梅总黄酮提取率随液料比的增大呈先增加后趋于平缓的趋势，表明对于一定质量的金露梅粉末物料，适当增加萃取溶液用量，有利于物料中黄酮物质的更好溶出，但萃取溶剂达一定量后，已足以应对物料中有限的黄酮溶出，再继续增加萃取溶剂用量，黄酮溶出的增量有限，反而会增加经济成本。金露梅粉末中的黄酮物质是根据相似相溶原理溶于乙醇溶液中，乙醇体积分数的增大，有利于金露梅中渗出的黄酮物质溶入乙醇溶液中，但单因素试验结果表明，乙醇体积分数并非越大越好，超过一定量后，反而不利于黄酮物质提取，可能是由于更高体积分数的溶液影响乙醇溶剂扩散通过金露梅的细胞壁，从而影响细胞质内有效物质的溶出。超声波辐射可产生强烈的空化效应、机械振动和扰动效应，可加速破坏植物细胞结构，导致细胞组织变形破损（薛宏坤等，2020），使得目标化合物能更快地被释放到提取溶液中，随着超声功率增大，超声波的这种功效越显著，但超声功率增大到一定程度后，反而会破坏萃取的黄酮化合物结构，从而导致总黄酮提取率降低。在超声时间达到一定程度后，如350 W下40 min的超声处理，已经使得金露梅粉末中的黄酮物质尽可能溶出，再继续延长超声时间，对提取量的作用不大，反而增加提取能耗。

通过设计正交试验，并利用响应面法分析可节省确定最优处理参数的时间，且这种方法在萃取领域已被广泛应用（韦璐等，2015;磨正遵等，2018），一般而言，通过该体系的预测值与测试值间未发现有显著差异。本研究利用Box-Behnken试验设计原理，设计4因素3水平试验，建立了回归方程，并利用该模型优化得到最佳提取条件，即液料比39.78∶1、乙醇体积分数65.47%、超声功率390.98 W、超声时间49.55 min，预测的金露梅总黄酮提取率与单次验证试验得到的提取率仅存在微小差异，表明成功获得了能准确描述金露梅总黄酮提取率的回归模型，再次验证了响应面分析法在植物提取领域的有效运用。

黄酮类化合物是一种强抗氧化剂，可有效清除人体内的过剩自由基，延缓组织器官衰老（Hoensch and Oertel，2011）。黄酮类化合物具有的较强清除自由基能力与其化合物结构中酚羟基数目和所处位置密切相关（Mojica et al.，2015;刘科梅等，2016）。酚羟基可将自由基转变成活性低的酚类自由基，打断自由基的链式反应，在弱酸性或中性条件时，邻位酚羟基还能与金属离子鳌合，抑制其对自由基生成和链反应的催化作用，同时酚羟基能显著抑制氧化酶活性，因此酚羟基是黄酮类化合物清除自由基功效中共性的活性基团（Ozkan et al.，2007;Li et al.，2013）。羟基数目越多，黄酮化合物抗氧化活性越强，而分子结构中B环是最主要的活性部位，尤其是B环上存在邻位酚羟基时，则抗氧化活性会显著增强（吴洪和高平章，2009;王谢祎，2016）。金露梅的黄酮类化合物中，柚皮素DPPH自由基清除率仅为5.0%，可能是由于柚皮素B环上只有4′-OH，不存在邻位酚羟基，而其他化合物的B环上均存在邻位酚羟基，因此表现出显著的抗氧化活性。

4 结论

经响应面优化的金露梅黄酮超声提取工艺切实可行，建立的回归方程具有较高的准确性;多重层析柱法可实现金露梅中黄酮化合物的分离纯化，各组分除柚皮素外，均具有明显的抗氧化活性，且各组分化合物均有一定的降血糖活性。金露梅可作为一种天然抗氧化剂和降血糖剂来源在食品、医药等方面进行开发利用。

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（責任编辑 罗 丽）