ADS-8型大孔吸附树脂纯化金针菇总黄酮工艺的优化及活性测定

王广慧 谭吉丽 杜艳超 杨静怡 尚雅楠 任丽娜

摘要：为了确定ADS-8型大孔吸附树脂纯化金针菇总黄酮工艺的最佳条件以及纯化后总黄酮的抑菌性和抗氧化性，通过静态吸附和解析试验，探讨了样品液pH、样品液浓度对树脂吸附总黄酮性能的影响，以及在以乙醇为洗脱液的情况下，洗脱液用量和洗脱剂体积分数对总黄酮解析效率的影响，并对纯化后的金针菇总黄酮抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌4个菌种以及清除2 ，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS·）的能力进行了检测。结果显示，纯化工艺的最佳条件为样品液pH为5，样品液浓度为1.19 mg/mL，洗脱液乙醇的体积分数为70%，乙醇用量为140 mL。在上述条件下金针菇总黄酮的纯化倍数是1.84倍;金针菇总黄酮对4种参测菌均具有抑制效果，抑菌能力大小依次为大肠杆菌>沙门氏菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌;金针菇总黄酮对ABTS·具有清除能力，说明其具有抗氧化性，但弱于对照维生素C。

关键词：ADS-8型大孔树脂;金针菇总黄酮;纯化;抑菌性;抗氧化性

中圖分类号：TS201.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）18-0112-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.022 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization and activity determination of total flavonoids from Flammulina velutipes

purified by ADS-8 macroporous adsorption resin

WANG Guang-hui，TAN Ji-li， DU Yan-chao， YANG Jing-yi， SHANG Ya-nan， REN Li-na

（College of Food and Pharmaceutical Engineering， Suihua University， Suihua  152061， Heilongjiang， China）

Abstract： In order to determine the optimal conditions for the purification of Flammulina velutipes flavonoids by ADS-8 macroporous resin and the antibacterial and antioxidative properties of flavonoids after purification， the effects of pH and concentration of sample solution on the adsorption properties of flavonoids in resin and the effects of eluent dosage and eluent volume fraction on the analytical efficiency of flavonoids in the case of ethanol as eluent were studied， and the ability of purified flavonoids to inhibit Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Bacillus subtilis and Salmonella enteritidis was tested. The ability of scavenging 2，2-diazo-bis （3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid） diammonium salt （ABTS·） was detected. The results showed that the optimal conditions for this purification process were that the pH of the sample solution was 5， the concentration of the sample solution was 1.19 mg/mL， the volume fraction of the eluent ethanol was 70%， and the amount of ethanol was 140 mL. Under the above conditions， the purification ratio of flavonoids was 1.84 times. The flavonoids had inhibitory effects on four kinds of reference bacteria. The order of antibacterial ability was Escherichia coli> Salmonella enteritidis>Staphylococcus aureus>Bacillus subtilis. The results showed that the total flavonoids of Flammulina velutipes had the ability of scavenging ABTS·， indicating that it had antioxidant activity， but weaker than vitamin C.

Key words： ADS-8 macroporous resin; Flammulina velutipes flavonoids; purification; antibacterial; antioxidant

金针菇[Flammulina velutipes]是世界上著名的食药两用菌，具有很高的营养价值和药用价值。现代药理研究表明，金针菇含有多种有效药用成分，特别是黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、抗炎、保护心脑血管系统等多种生物活性[1-3]，但是迄今为止，关于金针菇总黄酮纯化技术的研究并不是很多，而且所获得的总黄酮纯化效果一般。大孔吸附树脂是具有大孔结构并且不含交换基团的有机高聚物吸附剂，具有理化性质稳定、选择性好、不溶于碱酸及有机溶剂中、能够快速吸附且吸附容量大、再生容易、机械强度高等优点[4]。本研究分析了ADS-8型大孔吸附树脂纯化金针菇总黄酮工艺的最佳条件，并对纯化后总黄酮的抑菌和抗氧化能力进行了检测，以期为金针菇总黄酮的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ADS-8型大孔吸附树脂，购自上海莼试生物技术有限公司;试验所用各种化学试剂都为国产分析纯，购自常州市旭宏化工有限公司;金针菇、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大腸杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella enteritidis），取自绥化学院微生物实验室。木瓜蛋白酶、纤维素酶，购自北京奥博星生物科技有限责任公司。

1.2 主要仪器

752型紫外-可见分光光度计，购自上海菁华科技仪器有限公司;TGL-20bR型冷冻离心机，购自上海安亭科学仪器厂;YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂;牛津杯（内径6 mm），购自上海鲁硕实业有限公司;ZD-85型气浴恒温振荡器，购自江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮含量的测定方法 采用硝酸铝-亚硝酸钠法测定金针菇中总黄酮的含量。线性回归方程的获得方法参见文献[5]。

1.3.2 金针菇中总黄酮的提取 除去金针菇中杂质，在50 ℃烘箱中干燥，使用高速万能粉碎机粉碎（粉碎之后过80目筛），称取由此获得的子实体干粉，放入锥形瓶中，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 6）混匀，料液比为1∶35（g/mL）。然后加入由等质量的纤维素酶和木瓜蛋白酶混合而成的复合酶，酶用量为金针菇粉样品量的1.00%。将锥形瓶置于恒温水浴锅中进行酶解，温度为50 ℃，时间为80 min。酶解结束后在115 ℃下高压提取40 min。提取后离心，将上清液蒸发浓缩后用3倍体积的95%乙醇在4 ℃冰箱中沉淀12 h，离心，弃沉淀（含多糖、蛋白质等杂质），上清液备用[5]。

1.3.3 大孔吸附树脂的预处理 称取ADS-8型大孔树脂40 g置入250 mL具塞锥形瓶中，用体积分数为95%的乙醇浸泡24 h，然后用95%乙醇洗至流出的液体清亮、无浑浊为止，再用去离子水洗至液体无醇味。然后再分别用酸碱处理，即以浓度为5%（g/g）的HCl溶液浸泡4 h，用去离子水洗至中性，再用浓度为4%（g/g）的NaOH溶液浸泡4 h，用去离子水洗至中性，备用[6]。

1.3.4 树脂静态吸附和静态解吸动力学的研究

1）静态吸附动力学研究。称取已处理过的ADS-8型大孔树脂2 g置于具塞锥形瓶中，然后加入浓度为1.76 mg/mL的金针菇黄酮样品溶液100 mL，置于25 ℃、100 r/min的恒温振荡器中每隔2 h测定一次样品液中总黄酮的浓度，测定时间设定为2、4、6、8、10、12 h，测定至大孔树脂吸附饱和为止。绘制出大孔树脂的静态吸附动力学曲线。

[吸附率=C1V1-C2V2C1V1×100%]    （1）

式中，C1、C2分别表示初始样品液中黄酮浓度和吸附后溶液中黄酮浓度（mg/mL）;V1、V2分别表示初始样品液的体积和吸附后溶液的体积（mL）。

2）静态解吸动力学研究。将经过静态吸附的大孔树脂滤去上清液，然后用去离子水反复冲洗树脂直至上清液不再浑浊，加入体积分数为70%乙醇溶液100 mL，密封，然后放入气浴恒温振荡器中，设定温度为25 ℃、速度为100 r/min振荡12 h进行解吸，在不同时间（2、4、6、8、10、12 h）分别测定解析液吸光度，然后绘制静态解析曲线。

[解析率=C3V3C1V1-C2V2×100%]    （2）

式中，C1、C2、C3分别表示初始样品液中黄酮浓度、吸附后溶液中黄酮浓度以及解析液浓度（mg/mL）;V1、V2、V3分别表示初始样品液的体积和吸附后溶液的体积以及解析液体积（mL）。

1.4 树脂纯化金针菇黄酮工艺条件的优化

1.4.1 样品液pH对黄酮吸附率的影响 将5份等体积、质量浓度为1.76 mg/mL的金针菇黄酮提取液用浓度为5%的盐酸和浓度为2%的NaOH溶液调成pH为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，分别取60 mL于250 mL的装有2 g预处理后树脂的锥形瓶中，密封，并将其置于25 ℃、100 r/min恒温振荡器中振摇10 h，待其充分吸附后，静止2 h，以速度为3 000 r/min离心10 min，分别测定上清液体积及其中的黄酮浓度，并计算黄酮吸附率。然后将树脂用体积分数为70%的乙醇溶液洗脱后再生备用。

1.4.2 样品液浓度对黄酮吸附率的影响 将pH为5，浓度分别为0.64、1.19、1.76、2.29、2.87 mg/mL的金针菇黄酮样品液32 mL于250 mL的装有2 g预处理后树脂的三角瓶中进行试验，后续步骤同“1.4.1”。

1.4.3 洗脱剂体积分数对黄酮解析率的影响 将5份已饱和吸附金针菇黄酮的树脂先用去离子水冲洗至流出液无色，再分别用100 mL乙醇体积分数为 40%、50%、60%、70%、80%的洗脱剂在25 ℃、100 r/min条件下振荡10 h进行解吸。计算黄酮解析率。

1.4.4 洗脱剂用量对黄酮解析率的影响 将5份已饱和吸附金针菇黄酮的树脂先用去离子水冲洗至流出液无色，再分别用80、100、120、140、160 mL乙醇体积分数为70%的洗脱剂在25 ℃，以100 r/min振荡解吸10 h。计算黄酮解析率[7-9]。

1.5 工艺验证试验

分别取按最佳工艺条件纯化所获得的金针菇总黄酮解析液与纯化前总黄酮样品液放于烘箱中烘干，精确称取烘干后物质的干重，通过计算总黄酮在解析液及样品液烘干后物质中所占的比例，得到黄酮的纯化倍数，重复3次。

1.6 抑菌圈法检测纯化后金针菇总黄酮的抑菌性

将活化后的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌4个菌种在37 ℃恒温振荡器中以转速120 r/min连续培养至菌体浓度为1×106～1×107 CFU/mL（此时菌悬液在600 nm波长处OD值为0.1）。

在LB固体培养基上均匀涂布各菌悬液0.1 mL后插入牛津杯。将纯化后的金针菇黄酮样品液用生理盐水稀释成不同质量浓度，各取0.1 mL加入牛津杯中，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后测量抑菌圈大小。所有试验均设3组平行，以生理盐水作为对照 [10，11]。

1.7 金针菇黄酮的抗氧化性测定

通过测定金针菇黄酮对ABTS·的清除能力来检测其抗氧化性[11，12]。

称取ABTS 40.00 mg，加入去离子水10 mL，1.0 mg/mL的过硫酸钾8.00 mL，室温避光静置16 h，然后转移到250 mL容量瓶中，加32 mL去离子水，用无水乙醇定容至刻度，放置10 h备用。在5只试管中依次加入0.5 mL不同浓度的黄酮样品溶液、1.5 mL 95%乙醇、2 mL按上述方法配好的ABTS溶液，混合，静置，30 min后在734 nm波长下测得吸光度A1;用2 mL去离子水代替ABTS溶液，其他步骤同上，测得吸光度A2;保留ABTS溶液，但以95%乙醇代替黄酮提取液，其他步骤同上，测出吸光度A0。同时以维生素C作为对照。

[ABTS·清除率=A0A1-A2A0×100%]    （3）

2 结果与分析

2.1 线性回归方程

按照文献[5]所述方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.146 1x-0.023 8（R2=0.999），其中y为吸光度，x为芦丁浓度（mg/mL）。

2.2 树脂静态吸附和静态解吸动力学的研究结果

2.2.1 静态吸附动力学 树脂静态吸附曲线如图1所示。由图1可知，吸附时间为10 h时，吸附达到饱和。吸附时间不到10 h时树脂吸附的不完全，而若超过10 h后继续吸附则浪费时间和能源，所以后续试验的吸附时间都取10 h。

2.2.2 静态解析动力学 树脂静态解析曲线如图2所示。 由图2可知，树脂解析时间为10 h时，解析率达到最大，所以后续试验的解析时间都取10 h。

2.3 树脂纯化金针菇总黄酮工艺条件的优化

2.3.1 樣品液pH对金针菇总黄酮吸附率的影响 当样品液pH为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0时，金针菇中总黄酮吸附率分别为27.3%、38.1%、35.7%、33.7%、27.0%;当样品溶液pH为5.0时吸附率最大，随着pH从5.0到8.0不断升高，吸附率逐渐降低。可能是由于金针菇总黄酮是多羟基酚类化合物，呈弱酸性，在酸性条件时总黄酮能保持分子状态可以形成氢键，有利于大孔吸附树脂的吸附，而在碱性条件下总黄酮分子中羟基离子化，不利于氢键形成，从而导致吸附率降低。

2.3.2 样品液浓度对金针菇总黄酮吸附率的影响 当样品液浓度为0.64、1.19、1.76、2.29、2.87 mg/mL时，金针菇中总黄酮吸附率分别为33.5%、36.9%、31.7%、31.2%、29.5%;样品液浓度在1.19 mg/mL时吸附率最大，但当样品液浓度超过1.19 mg/mL后，吸附率逐渐下降。可能是因为当样品液浓度过低时，树脂吸附不完全，随着样品液浓度的增大，树脂吸附量增加。而当样品液浓度过大时，与总黄酮竞争树脂吸附点的杂质增多，所以饱和吸附率降低。

2.3.3 洗脱液体积分数对金针菇总黄酮解析率的影响 当洗脱液乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%时，金针菇中总黄酮吸附率分别为52.3%、63.7%、70.6%、74.3%、51.0%;随着洗脱液乙醇的体积分数逐渐增大，解析率也逐渐增加，当体积分数为70%时解析率最大，但超过70%后，解析率反而下降。可能是因为在洗脱液浓度过大时会洗下大量杂质，从而降低总黄酮解析率，而当洗脱液浓度较小时则会导致总黄酮洗脱不完全而使洗脱效率变差。

2.3.4 洗脱剂用量对金针菇总黄酮解析率的影响 当洗脱液乙醇用量为80、100、120、140、160 mL时，金针菇中总黄酮吸附率分别为51.7%、74.5%、81.3%、91.7%、91.7%;随着洗脱剂用量的增加，解析率逐渐增大，在140 mL时达到最大值，即使用量继续增大，解析率也不会再增大，所以洗脱液的最佳用量为140 mL。

2.3.5 工艺验证试验 由表1可知，金针菇总黄酮解析液经以上最佳工艺条件的纯化，纯化倍数为1.86倍。

2.4 纯化后金针菇总黄酮的抑菌能力

对每个金针菇总黄酮浓度下3次平行试验所获得的抑菌圈直径取平均值，所得结果见表2。由表2可知，在0.25～0.65 mg/mL浓度范围内，对4个菌种的抑菌能力与金针菇总黄酮浓度呈正相关，抑菌程度大小顺序为大肠杆菌>沙门氏菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌。

2.5 金针菇总黄酮的抗氧化性

金针菇总黄酮和维生素C对ABTS·清除率的检测结果见图3。由图3可知，在所测浓度范围内，2种物质对ABTS·的清除能力都随浓度增加而加强，在同浓度下，金针菇总黄酮的清除率弱于维生素C，但二者差距随浓度提高而缩小。

3 小结

通过单因素试验对ADS-8型大孔吸附树脂纯化金针菇总黄酮的工艺条件进行了优化研究，并对纯化后总黄酮的抑菌及抗氧化性进行了检测。根据研究结果得出如下结论：

1）ADS-8型大孔吸附树脂纯化金针菇总黄酮的最优条件为样品液pH为5，样品液浓度为1.19 mg/mL，洗脱液乙醇的体积分数为70%，乙醇体积为140 mL。在此条件下进行3次验证试验，金针菇总黄酮的纯化倍数为1.84倍。

2）抑菌性研究结果表明，金针菇总黄酮对4种测试菌均显示出抑菌效果，且抑菌能力与金针菇总黄酮浓度呈正相关。对4种菌的抑菌能力排列顺序为大肠杆菌>沙门氏菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌。

3）抗氧化研究结果表明，金针菇总黄酮对ABTS·具有一定的清除能力，显示其具有一定的抗氧化能力，且随着总黄酮浓度的增大而增强，但其抗氧化性弱于同浓度下的维生素C。

综上所述，利用ADS-8型大孔树脂对金针菇总黄酮进行纯化的工艺可行，为金针菇总黄酮的开发利用提供了参考。

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