组蛋白去乙酰化酶抑制剂对核移植胚胎体外发育效果影响的研究进展

吕玲燕 吴永绍 张家庆 孙如玉 汪燕玲 潘天彪 陈宝剑 谢炳坤

摘要：組蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）是一类化合物，通过干扰组蛋白去乙酰化酶来控制DNA缠绕于组蛋白的松紧程度从而发挥作用，它可以通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度提高乙酰化相关基因的表达水平。近年来，关于HDACi促进供体细胞及核移植重构胚的表观遗传重编程以及调控高等动物机体基因的表达等相关研究备受关注。主要阐述了HDACi对核移植胚胎体外发育效果的影响，旨在为提高克隆胚胎的生产效率提供参考依据。

关键词：组蛋白去乙酰化酶抑制剂;核移植;胚胎;发育效果

中图分类号：Q132.4         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）18-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.001

Research progress on the effects of histone deacetylase inhibitors on in vitro

developmental competence of nuclear transfer embryos

LYU Ling-yan1， WU Yong-shao1， ZHANG Jia-qing2， SUN Ru-yu1，WANG Yan-ling1，

PAN Tian-biao1， CHEN Bao-jian1， XIE Bing-kun1

（1. Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement/Guangxi Institute of Animal Sciences， Nanning  530001，China;

2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou  450002， China）

Abstract： Histone deacetylase inhibitor （HDACi） is a class of compounds that can interfere with histone deacetylase to control the tightness of DNA binding to histones and play a role， which can increase the degree of histones acetylation in cells and improve the expression level of acetylated genes. In recent years， the researches on HDACi promoting epigenetic reprogramming of donor cells and nucleartransfer embryos and regulating the genes expression in higher animals have attracted much attention. The effects of HDACi on the in vitro developmental competence of nuclear transfer embryos are mainly described， in order to provide reference for improving the production efficiency of cloned embryos.

Key words： histone deacetylase inhibitors; nuclear？transfer; embryos; developmental competence

体细胞核移植（SCNT）对于生产转基因动物[1]和保护种质资源[2]是一种普通但非常重要的技术手段。因此，使用体细胞核移植技术进行动物克隆被认为是一项尖端的革命性技术。尽管一些哺乳动物物种已经被成功克隆[3]，但克隆动物生产效率仍然较低，其中的一个根本问题就是在核移植胚胎发育过程中，胚胎染色体进行错误的或者不完全表观遗传重编程[4]，从而使发育过程中具有重要作用的基因发生异常表达。表观遗传修饰如DNA甲基化和组蛋白乙酰化等已被证实能调控高等动物机体基因的表达[5]。组蛋白乙酰化是哺乳动物胚胎发育和后天生长中研究最多也是最具代表性的表观遗传修饰之一，是相对稳定的修饰机制。在供体细胞和核移植胚胎中组蛋白高乙酰化水平可以进一步提高其发育能力[6，7]。因此，科学家们使用了多种与表观遗传修饰相关的组蛋白酶抑制剂（HDACi）去改善核移植胚胎发育过程中的组蛋白乙酰化水平，从而提高克隆胚胎体外发育能力[8-11]。Cao等[12]研究表明，使用HDACi处理核移植供体细胞，使其G0/G1期比例提高，有利于核移植胚胎体外发育，并且能使H4K12、H3K9乙酰化水平提高。Sun等[13]研究表明，使用HDACi处理克隆重构胚胎，可提高H4K8乙酰化表达水平，并且促进克隆胚胎体外发育。Li等[14]研究表明，使用HDACi处理核移植供体细胞，能够提高多能性基因的表达，并且可影响组蛋白甲基化H3K4me3、H3K9me2位点的表达，从而促进克隆胚胎发育。本研究主要针对HDACi对SCNT胚胎体外发育效果的影响进行综述，为提高体细胞克隆胚胎生产效率提供参考依据。

1 HDACi的作用及分类

HDACi通过控制DNA缠绕于组蛋白的松紧程度来发挥作用，可以通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度、提高p21等基因的表达水平等途径，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞分化和凋亡。HDACi按其结构不同，可分为四类：第一类为脂肪酸，如丁酸盐、丁酸苯酯和丙戊酸，其中丙戊酸被用作抗癫痫药物;第二类为氧肟酸盐，如TSA是被发现的第一个能抑制HDACs的天然氧肟酸; 第三类为环肽，如天然产物缩酚酸肽FK-228和环氧肟酸;第四类为苯酰胺类，如MS-275、MGCD0103;有些HDACi如TSA、SAHA属非选择性，可同时抑制Ⅰ类及Ⅱ类 HDACs;有些 HDACi属于选择性的，如 MS-275对Ⅰ类HDACs的抑制作用强于Ⅲ类HDACs，而对HDAC6、 HDAC8几乎没有影响。在SCNT上应用最多的HDACi主要为TSA、VPA、Scriptaid以及SAHA。

2 HDACi对体细胞的影响

供体细胞的细胞周期对体细胞克隆的成败至关重要。王张凡[15]研究表明，用0.1 μmol/L FK228单独处理供体细胞24 h，供体细胞形态变化不明显，存活数最多，且细胞染色体数目正常率无显著变化，也有助于促进猪体细胞克隆胚胎体外发育。道日诺[16]研究表明，用低于0.40 μmol/L的TSA处理牛胎儿成纤维细胞，不影响其形态，而以高于0.40 μmol/L的TSA处理牛胎儿成纤维细胞时，随TSA浓度增大、处理时间延长，脱壁的死细胞数目逐渐增加;低于0.80 μmol/L的TSA处理牛胎儿成纤维细胞24、48、72 h后，均使G0/G1期细胞比例显著增高，S期和G2/M期细胞比例显著降低，G0/G1期细胞比例增高，有利于供体细胞在核移植时进行重编程。阮秋燕等[17]研究表明，0、250、500、750 nmol/L  4组浓度Scriptaid处理水牛胎儿成纤维细胞（BFF），其对BFF细胞形态和存活率影响不大，且能显著提高BFF的acH4K18组蛋白乙酰化水平，有利于供体细胞进行核移植。高川等[18]研究表明，用适宜浓度的Scriptaid处理牦牛胎儿成纤维细胞24 h后，细胞形态发生了改变，细胞增殖受到明显抑制，大量细胞被阻滞在G0/G1期，随着Scriptaid处理浓度的增加，细胞组蛋白H3K9ac乙酰化水平逐渐提高，其研究初步证实，Scriptaid是通过提高成纤维细胞的乙酰化水平来促进核的重编程。肖刚峰等[19]研究表明，用组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA处理小鼠T淋巴瘤细胞EL4，能够恢复或提高小鼠T淋巴瘤细胞EL4中miR-150表达并抑制T淋巴瘤细胞EL4细胞增殖。魏丽晓等[20]研究表明，采用不同浓度SAHA处理山羊胎儿成纤维细胞（Goat embryonic fibroblasts，GEFs），2.5 μmol/L SAHA处理浓度即可显著提高GEFs组蛋白H3K9的乙酰化水平，提高体细胞核移植效率。白力[21]研究表明，采用0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L 4种浓度VPA处理牛体细胞24 h后，随着处理浓度的升高G0/G1期和G2/M期细胞增多，S期细胞减少，表明VPA具有将细胞阻滞在G0/G1期的作用，且隨着VPA浓度和时间的增加，VPA的周期阻滞作用愈加明显，G0/G1期细胞比例增加，而且牛胎儿成纤维细胞H3K9和H4K5组蛋白乙酰化水平显著提高，有利于进行体细胞核移植。以上研究结果表明，HDACi可通过调节供体细胞周期提高克隆效率;HDACi能促进供体细胞不同组蛋白位点呈现高水平的乙酰化状态，有助于核移植后重编程，促进胚胎发育;HDACi能抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞分化和凋亡。

3 HDACi对SCNT重构胚胎发育的影响

利用HDACi处理供体细胞后，能对SCNT重构胚胎早期发育产生影响。第一次被应用在SCNT中的HDACi是TSA。Luo等[22]研究表明，用0.15、0.3 μmol/L TSA处理牛供体细胞48 h可显著提高SCNT胚胎的卵裂率和囊胚率。Wei等[23]研究表明，使用TSA处理可提高H3K14、H4K12乙酰化水平，从而促进SCNT胚胎体外发育率。然而，TSA本身有一定的副作用即细胞毒性较强，所以不同物种体细胞的耐受性决定了TSA重编程效率的高低，同时决定了核移植胚胎的体外发育能力[24]。VPA毒性较TSA低，且具有较高的组蛋白乙酰化活性。Miyoshi等[25]研究表明，使用VPA处理猪SCNT胚胎，可显著提高胚胎体外发育率的同时提高多能性基因的表达。Xu等[26]研究表明，使用VPA处理牛SCNT胚胎，可显著提高牛胚胎体外发育率，同时显著增加组蛋白H3K9的乙酰化水平。Isaji等[27]研究表明，相比TSA而言，VPA可以更加高效地提升重构胚的发育能力，并且可以改善小鼠克隆胚胎中H3K27me3的分布以及多能性基因的表达水平。相比TSA、VPA而言，Scriptaid是一种毒性更低的人工合成的HDACi，Van Thuan等[28]研究表明，用250 nmol/L Scriptaid处理SCNT胚胎10 h后，不仅显著提高了重构胚胎体外发育能力，同时也获得了克隆小鼠。以上研究结果表明，由于物种体细胞的耐受性差异，不同HDACi处理供体细胞、重构胚胎，对于提高SCNT胚胎体外发育率各不相同;HDACi有利于SCNT胚胎的早期发育，可用于提高其体外生产效率。

4 HDACi对SCNT胚胎早期发育机制的影响

表观遗传修饰主要发生在胚胎发育的早期阶段，并与其发育潜能有关，因此这些表观遗传标记可用来预测SCNT效率。组蛋白乙酰基转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）可以通过修饰N-末端保守的赖氨酸残基部位来调控组蛋白的乙酰化模式。组蛋白乙酰化可以促进转录，这是因为高的乙酰化水平可以影响染色体中组蛋白和染色质之间的相互作用，这一过程促进了转录因子的结合、调节了蛋白质和组蛋白N-末端的作用[29]。Selokar等[30]研究表明，使用2.5～10.0 mmol/L VPA处理牛供体细胞24 h后，其克隆囊胚中H3K9me3水平显著低于未经处理的克隆胚胎，并使表观遗传状态更接近IVF胚胎。Bui等[31]研究表明，在猪的SCNT过程中，H3K16、H3K14、H3K9 3个位点的乙酰化水平先下降，之后恢复到与孤雌激活胚胎乙酰化水平相似程度。Wang等[32]研究表明，在小鼠的SCNT过程中，H3K14和H3K9的超乙酰化发生在SCNT之后，然而组蛋白乙酰化修饰程度的下降是发生在核质重构之后。

HDACi能促进组蛋白乙酰化，间接导致染色质构型的改变，染色质重塑对基因表达十分重要，疏松型染色质可以促进基因的表达。在哺乳动物早期胚胎重要的转录调控因子中，多能性基因OCT4、NANOG、CDX2和SOX2在胚胎发育早期起关键作用。魏丽晓等[20]研究发现，2.5 μmol/L SAHA处理山羊胎儿成纤维细胞24 h 后，克隆胚胎中囊胚的Oct4、Sox2、Nanog表达水平均显著高于未处理囊胚。Lager等[33]研究发现，使用50 nmol/L TSA处理牛重构胚13 h后，Nanog和Cdx2表达量显著上调，且高于IVF胚胎。

在SCNT胚胎中，細胞凋亡是影响胚胎质量的关键因素。Cui等[34]研究发现，用0.05 μmol/L TSA处理牛重构胚10 h后可上调抗凋亡基因Bcl-xL的表达，下调促凋亡基因Bax的表达，并且用TSA处理后，可影响重构胚中miRNA的表达，SCNT胚胎中miRNA-21表达量低于IVF胚胎，而TSA处理可使其表达量增加，增强细胞的抗凋亡能力，从而促进牛克隆胚胎的发育。

以上研究结果表明，不完全的组蛋白乙酰化的重编程都会发生在不同物种的SCNT胚胎中;HDACi在一定程度上对SCNT胚胎的表观遗传重编程异常有修复作用，可使SCNT胚胎的表观遗传修饰水平更接近IVF胚胎;HDACi能使染色质结构重塑并对多潜能基因的表达有显著影响;HDACi处理可抑制细胞凋亡，促进胚胎的进一步发育。

5 小结

HDACi作为一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在克隆胚胎的表观遗传修饰及发育方面具有积极的促进作用。但由于HDACi种类繁多及处理效果受动物物种种类、时间、浓度等多种因素影响，因此，开发高效、低毒副作用的HDACi和优化处理条件对提高重编程效率、促进胚胎发育至关重要。此外，HDACi的具体作用机制及克隆胚胎移植后出生胎儿能否正常生长、发育仍需要进一步研究。

参考文献：

[1] YUM S Y， YOUN K Y， CHOI W J， et al. Development of genome engineering technologies in cattle： From random to specific[J]. Journal of animal science and biotechnology， 2018， 9（1）：16.

[2] GOMEZ M C， POPE C E， RICKS D M， et al. Cloning endangered felids using heterospecific donor oocytes andinterspecies embryo transfer[J]. Fertility and development， 2009， 21（1）：76-82.

[3] RODRIGUEZ-OSORIO N， URREGO R， CIBELLI J B， et al. Reprogramming mammalian somatic cells[J]. Theriogenology， 2012， 78（9）：1869-1886.

[4] AKAGI S， MATSUKAWA K， TAKAHASHI S. Factors affecting the development of somatic cell nuclear transfer embryos in cattle[J]. Journal of reproduction and development，2014，60（5）：329-335.

[5] BOURC'HIS D， LE BOURHIS D， PATIN D， et al. Delayed and incomplete reprogramming of chromosome methylation patterns in bovine cloned embryos[J].Current biology， 2001，11（19）：1542-1546.

[6] WANG Y S，XIONG X R，AN Z X，et al. Production of cloned calves by combination treatment of both donor cells and early cloned embryos with 5-aza-2-deoxycytidine and trichostatin A[J]. Theriogenology， 2011， 75（5）：819-825.

[7] LI J， SVARCOVA O， VILLEMOES K， et al. High in vitro development after somatic cell nucleartransfer and trichostatin A treatment of reconstructed porcine embryos[J].Theriogenology，2008，70（5）：800-808.

[8] HUANG Y， TANG X， XIE W， et al. Histone deacetylase inhibitor significantly improvedthe cloning efficiency of porcine somatic cell nuclear transfer embryos[J]. Cell reprogramming， 2011，13（6）：513-520.

[9] AKAGI S， GESHI M， NAGAI T. Recent progress in bovine somatic cellnuclear transfer[J]. Animal science journal， 2013，84（3）：191-199.

[10] AZUMA R， MIYAMOTO K， OIKAWA M， et al. Combinational treatment of trichostatin a and vitamin C improvesthe efficiency of cloning mice by somatic cell nuclear transfer[J]. Journal of visualized experiments，2018，134：57036.

[27] ISAJI Y，MURATA M，TAKAGUCHI N，et al. Valproic acid treatment from the 4-cell stage improves Oct4 expression and nuclear distribution of histone H3K27me3 in mouse cloned blastocysts[J].Journal of reproduction and development，2013，59（2）：196-204.

[28] VAN THUAN N， BUI H T， KIM J H， et al. The histone deacetylase inhibitor scriptaid enhances nascent mRNA production and rescues full-term development in cloned inbred mice[J].Reproduction，2009， 138（2）：309-317.

[29] GARCIA B A，HAKE S B，DIAZ R L，et al. Organismal differences in post-translational modifications in histones H3 and H4[J]. Journal of biological chemistry，2007，282（10）：7641-7655.

[30] SELOKAR N L， ST JOHN L， REVAY T， et al. Effect of histone deacetylase inhibitor valproic acid treatment ondonor cell growth characteristics，cell cycle arrest， apoptosis， and handmade cloned bovine embryo productionefficiency[J].Cell reprogramming，2013，15（6）： 531-542.

[31] BUI H T， VAN THUAN N，WAKAYAMA T，et al. Chromatin remodeling in somatic cells injected into mature pig oocytes[J].Reproduction，2006，131（6）：1037-1049.

[32] WANG F C，KOU Z H， ZHANG Y，et al. Dynamic reprogramming of histone acetylation and methylation in the first cell cycle of cloned mouse embryos[J]. Biology of reproduction，2007，77（6）：1007-1016.

[33] LAGER A E， RAGINA N P， ROSS P J， et al. Trichostatin A improves histone acetylation in bovine somatic cell nuclear transfer early embryos[J]. Cloning stem cells， 2008， 10（3）： 371-379.

[34] CUI X S， XU Y N， SHEN X H， et al. Trichostatin A modulates apoptotic-related gene expression and improves embryo viability in cloned bovine embryos[J]. Cell reprogramming， 2011， 13（2）： 179-189.