八角金盘果实色素的急毒性研究

孙千鸿 崔小燕 杨惠程

(昆明医科大学海源学院 化学生化综合实验室， 云南 昆明 651000)

八角金盘(FatsiaJaponicaThunb.Decne.etPlanch)为伞形目五加科八角金盘属，本属有两种分布于日本和台湾。目前国内对其研究主要在园艺种植领域和药用价值方面。最近研究主要集中在八角金盘籽油和果油的超声波-微波协同提取及脂肪酸组成比较[1]，八角金盘茎、叶、花(果实)中精油的化学成分分析[2]，八角金盘根、花和种子含三萜皂苷、常春藤苷元和多种果酸[3]及其花中黄酮[4]和果实色素的理化性质研究[5],八角金盘在治疗肝癌方面的研究[6]等，但对于八角金盘果实色素作为食品添加剂的可行性研究较少，为了进一步确定该色素的安全性，本文进行了动物急毒性和抗氧化性研究。

1 材料

1.1 原料

八角金盘果实采摘于12月昆明医科大学海源学院杨林校区种植区域，采用未进行过任何杀虫剂和化学肥料影响的植株，选饱满黑色果为提取原料。

1.2 试剂

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供，乙醇为分析纯，蒸馏水。

1.3 动物

清洁级昆明种小鼠，体重18～22 g雌、雄小鼠，均由具备实验动物资质的昆明艾尼莫实验动物养殖中心提供。

1.4 仪器

美国奥豪斯PX224ZH电子分析天平、上海屹尧微波萃取仪XT-T6、上海美普达PV1可见分光光度计、德国普兰德微量移液器、玻璃匀浆器、RE2000A上海亚容旋转蒸发仪、TD6长沙英泰离心机、循环水真空泵等。

2 方法

2.1 八角金盘果实色素的提取

采用微波辅助法提取八角金盘果实色素，前期处理果实为干燥颗粒，经粉碎后(20目)过筛，提取液为酸性95%乙醇溶液，采用微波功率400 W，提取时间180 s，提取次数4次，料液比1∶60，粗提液过滤后通过大孔树脂静态吸附2 h后纯化色素，色素液通过旋转蒸发仪蒸发(45 ℃，80 r/m)。减压状态下，蒸发至凝胶状后转移到50 ℃的恒温干燥箱进行处理，将干燥后块状物做成粉剂备用。

2.2 实验动物分组和给药

选用体重18～22 g、6～7周龄的昆明种小鼠、雌雄性各10只，随机分组，采用寇氏法进行剂量组的确定，可按照剂量等距设计实验组数，确定受试物剂量为1.008、1.814、3.265、5.877、10.578、19.041 g/kg，空白组采用蒸馏水(八角金盘果实色素采用蒸馏水配制)。

2.3 观察指标

预实验进行眼口鼻的刺激性观察，判断对皮肤的刺激性。按照剂量组计算每组给药浓度进行灌胃，实验前对动物禁食16 h、正常饮水，以2 ml/100 g灌胃容量进行灌胃，一天内间隔6 h进行3次灌胃，观察14天后脱颈处死并进行内脏器官的观察和生化指标测定，同时完成动物中毒症状和死亡数据的记录。

2.3.1 体重指标

统计和记录灌胃给药后14天的变化，每天进行称重记录，对一周和两周指标进行统计分析。

2.3.2 脏器系数

给药后观察14天脱颈处死，取肝、肾、肺、脾、心进行质量统计，进行小鼠器官重量与体重的比值(mg/g),同时观察各器官的组织变化。

2.3.3 抗氧化指标检测

主要针对小鼠肝组织进行过氧化氢酶CAT、超氧化歧化酶SOD、丙二醛MDA的测定，对八角金盘果实色素在小鼠机体内的抗氧化作用进行初步评估。

2.4 统计学处理

所有数据均进行分析，不相同的实验组使用单因素方差分析，相关性数据使用IBM SPSS statistics26软件处理，p<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 分组给药后动物死亡情况和LD50确定

灌胃后观察动物中毒表现，按照规范要求进行急性毒性实验记录，连续14天观察动物体重、死亡数量及解剖所见，如表1所示。

表1 八角金盘果实色素对小鼠的急毒性分析Tab. 1 Effects of extract from berries of Fatsja japonica bark on acute toxicity study of mice

根据寇氏法[7]的要求设计5～10组，每组动物数量6～10只。剂量通过最小剂量和最大剂量之差进行对数等距分组，计算LD50及95%平均可信限。实验满足全死亡和零死亡的剂量设计，使用计算公式log LD50=Xm-i(∑P-0.5)，95%平均可信限为log-1(log LD50±1.96Slog LD50),Sx50是log LD50的标准误差。八角金盘果实色素LD50为7.017 8 g/kg，Sx50为0.065 5，95%可信限为5.222 g/kg～9.432 g/kg，根据食品安全毒理学评价标准，判断八角金盘果实色素属于实际无毒级。

3.2 体重

灌胃后14天观察记录小鼠体重变化，通过与空白组对照和观察(如表2所示)，在受试物19.041 g/kg大剂量灌胃组出现较为明显的体重和进食减少，精神状态不佳，在8天后有明显恢复，因此大剂量的受试物对小鼠体重有一定影响。雌性和雄性小鼠在体重变化上p>0.05未出现明显差异。空白组与高剂量组体重统计差值的显著性p<0.05，说明高剂量的受试物对小鼠体重的影响明显。同时由于观察时间较短，体重统计标准偏差较大，建议延长观察时间有利于受试物和体重的统计关系更准确。

表2 八角金盘果实色素对小鼠体重的影响Tab. 2 Effects of extract from Fatsja japonica on bady weights of mice

3.3 脏器系数

脏器系数是毒理实验中常用指标，可利用肝、肾、肺、脾、心的重量与动物体重比值，评价受试物对动物脏器影响程度。对比正常时与染毒后各脏器与体重的比值的变化，对脏器系数增大的情况，判断是否伴随脏器充血、水肿或增生肥大等可能性；脏器系数减小，具有脏器萎缩及其他退行性改变的可能。从表3可见八角金盘果实色素对小鼠心、肝、肾、脾和肺的影响在与空白组对照中，表现出高剂量组19.041 g/kg、10.578 g/kg)的脾脏系数p<0.01有显著差异性。说明大剂量灌胃受试物后小鼠脾脏有肿大情况，观察有部分小鼠脾脏颜色稍有加深，不排除色素对脾脏有一定的影响。雌雄小鼠的脏器系数对比未见明显差异，说明八角金盘果实色素的作用受小鼠性别影响不大。

表3 八角金盘果实色素对小鼠主要脏器系数的影响Tab. 3 Effects of extract fromFatsja japonica on mice of viscera/body weight

3.4 血清生化指标检测

通过对肝组织的抗氧化指标的检测，进一步探究八角金盘果实色素对小鼠体内自由基的清除是否有帮助，对机体内脂质过氧化的程度和催化细胞内过氧化氢分解防氧化是否具有影响。为了减小误差，采用取量比较大的肝脏进行实验，根据测试盒要求进行10%肝组织匀浆液的制备，通过匀浆浓度曲线选择最佳取样浓度为1%，测定总蛋白量后开始过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)三个指标的检测，结果如表4所示。

表4 八角金盘果实色素对小鼠机体抗氧化能力的影响Tab. 4 Effects of extract from Fatsja japonica bark on oxidation resistance

从表4中可见三个指标在雌雄动物的对比p>0.05，无显著性差异。随着八角金盘果实色素剂量的增加，CAT值显著增加，尤其在大剂量灌胃后数值与空白组对比p<0.01，有显著差异性变化。说明八角金盘果实色素可促进机体过氧化氢酶的产生，显现出该色素对小鼠机体具有抗氧化的能力。同时SOD活性值表现出先升高后降低的情况，分析可见其在5.877 g/kg剂量组后再增加受试物剂量，SOD活性明显低于空白组(p<0.01)。小鼠肝脏中MDA含量随受试物剂量的增加而升高，在高剂量与空白组对比(p<0.01)有显著性表现。分析八角金盘果实色素在小鼠机体内抗氧化性与受试物剂量有相关性，同时高剂量灌胃后，小鼠机体表现出抗氧化性的抑制作用和体内脂质过氧化的程度增加。

4 讨论

八角金盘果实色素经灌胃进行急毒性实验，测定出LD50为7.0178 g/kg，Sx50为0.065 5,95%，可信限为5.222 g/kg～9.432 g/kg，依据急性毒性剂量分级为实际无毒级。

八角金盘果实色素在灌胃之后，大剂量组出现食欲不振情况，同时根据体重数据分析说明大剂量灌胃后对小鼠的体重增长有影响。对小鼠脏器系数的分析和器官形态的观察结果，说明八角金盘果实色素对脾脏有一定影响，具体影响因素有待进一步研究。同时对小鼠肝脏中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量进行测定，结果表示八角金盘果实色素的抗氧化性在小鼠机体内表现出低剂量有积极的抗氧化性，超过一定剂量后出现抑制作用和过氧化脂质程度明显，说明抗氧化性与受试物有明显剂量关系。由于三个指标分析中标准偏差较大，初步分析可能由于给药时间和观察时间较短，部分抗氧化指标和成分还来不及代谢就进行检测导致存在误差。建议后期抗氧化指标检测可以在喂养28天实验中进行，可保证数据更加准确。同时在多个指标的测定中，雌雄小鼠的性别差异性较小，可为后期实验数据分析作参考。