双歧杆菌多糖对秀丽隐杆线虫冷冻保存的影响

□ 郜鑫洋 陈树兴

（河南科技大学，河南 洛阳 471000）

秀丽隐杆线虫是一种常见的模式生物，寿命为14～21天。拥有1万个碱基，1.78万个不同基因，959个体细胞和300个神经元，因为它们结构简单、世代周期短并且易于繁殖，是生物科学研究中应用最普遍的模式生物［1-3］。而双歧杆菌是一种普遍存在于人和动物体内的益生菌，它们能够产生具有多种生物功能的胞外多糖，并且已经能够被提取、分离和纯化，并进行其各种特性的研究。由于秀丽隐杆线虫是十分常用的模式生物被广泛应用于遗传学、毒理学乃至植物寄生线虫等方面（秀丽隐杆线虫拥有许多和植物寄生线虫相似的特征），所以研究其较简便且能长期保存的方法，具有现实意义。同时，双歧杆菌胞外多糖已被证明拥有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等功能。如果能够证明双歧杆菌胞外多糖能够提高生物的低温抗性，那么对开发新的冷冻保护液很有帮助，对双歧杆菌及产物的研究也具有重要意义。

一、实验与方法

（一）材料

供试线虫品系为本实验室保藏的N2野生型秀丽隐杆线虫，购买自省内实验室。其保存条件为：-80℃超低温冰箱中冷冻保存。

双歧杆菌：供试双歧杆菌为RH型动物双歧杆菌，来自百岁老人的肠道，由本实验室人员分离、培养并保存。保藏方式为：-20℃低温冰箱冷冻保存。

大肠杆菌：供试大肠杆菌为OP50尿嘧啶突变型，为本实验室保藏菌种。保存方式为：-20℃低温冷冻保存。

LB培养基：1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5gNaCl（固体培养基需要加入1.7g琼脂粉），加水定容至100ml，溶解后高压灭菌（115℃，15min），冷却后放入4℃冰箱中备用。

NGM培养基：取0.3gNaCl、1.7g琼脂、0.25g蛋白胨、2.5mlPBS缓冲液，加水定容至100ml后高压灭菌（115℃，15min），待培养液降温至60℃后再加入胆固醇乙醇溶液O.1mL（5mg/mL）、MgS04 0.1mL（1mol/L）、CaCl2 0.1mL（1mol/L）。然后迅速摇匀并倒平板制得NGM固体培养基，4℃冰箱冷藏备用。

脱脂乳培养基：脱脂乳粉120g、1000mL蒸馏水充氮气，105℃灭菌10min。

双歧杆菌酶解液：中性蛋白酶、胰蛋白酶质量比为1∶2混合酶2g，加入蒸馏水1000ml（注意：酶解液要现配现用）。

秀丽隐杆线虫裂解液：NaOH0.6g、10%NaCl溶液100μl、无菌水49.9ml。

冷冻保护液：M9缓冲液、甘油体积比为7∶3，之后根据需要加入双歧杆菌多糖溶液。加入后混匀。注意，此保护液现配现用。

（二）方法

1.秀丽隐杆线虫的培养

大肠杆菌OP50的培养：取1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5g氯化钠、1.7g琼脂粉，加水定容至100ml配制成LB固体培养基，高压灭菌后倒平板，待平板凝固后，使用接种取大肠杆菌OP50菌种液进行划线培养（注意：每划一次线，都有将接种环在酒精灯火焰上灼烧，待冷却后再划，重复3次），划线后，将培养皿放在37℃恒温培养箱中培养72h。

大肠杆菌OP50悬液的制备：配制LB液体培养基：取1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5g氯化钠加水定容至100ml后高压灭菌，冷却后取出划线培养基在超净工作台中使用接种环挑取单个菌落放入LB液体培养基中，37℃摇床培养24h。之后，将菌液放入4℃冰箱中冷藏备用。

秀丽隐杆线虫虫体的培养：取冻存的秀丽隐杆线虫样本，在37℃水浴中解冻复苏后接种到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上进行培养，注意扩大培养，扩大培养方法是：每天取数只雌雄同体产卵期秀丽隐杆线虫，用显微钩针转移至新的培养皿上进行培养。培养数代后进行同步化处理，为接下来的冷冻保存实验做准备。

同步化处理（又称同期化培养）：使用M9缓冲液冲洗培养基上的线虫，冲洗完毕后，转移到锥形瓶中静置20min，之后加入裂解液，震荡裂解15min后，分装入4ml离心管。2517g离心1min后，沉淀用4ml缓冲液悬浮后离心，沉淀再加入无菌水悬浮后离心重复3次，之后在沉淀中加入1ml无菌水，放入NGM培养基中22℃培养7d。注意，第二次培养时涂布的菌液要少一些，以便于获得dauer期幼虫。［4］因为dauer期幼虫拥有更强的抗逆性。

2.RH双歧杆菌胞外多糖EPS的制备分离和纯化［5］

产糖发酵：菌种在脱脂乳培养基中活化3代，取对数末期培养液接种至新鲜无菌脱脂乳培养基，接种量为107CFU／mL，于37℃厌氧发酵60 h得到发酵液。

酶解：将双歧杆菌发酵液用4层医用纱布过滤，除去酸沉酪蛋白块。过滤液100℃加热5min，8000 r／min离心10 min后取上清液。冷却后，将上清液pH调节至7.5，之后加入2g/ml酶解液酶解120min。

分离，提取与纯化：将酶解液在沸水浴中灭酶5min，待酶解液冷却后8000 r／min离心10min；上清液中加入3倍体积无水乙醇，4℃沉淀过夜，沉淀用少量蒸馏水复溶，8 000～12000D透析袋4℃透析48h，真空冷冻干燥后获得EPS粗品，粗品需避光干燥保存。

将分离、提取获得的EPS粗品配制成5mg/ml糖液。45 μm水系滤膜过滤后进行Sepharose CL.6B凝胶柱层析，上样量为4ml用0.05mol／lNaCl恒速洗脱，洗脱速率为0.8mL／min，每管8mL部分收集，并使用硫酸-苯酚测定A480mm法［7］逐管检测多糖含量，按多糖含量检测值收集峰值管，8000～12000D透析袋透析并冷冻干燥，获得成品。

3.线虫冷冻实验

秀丽隐杆线虫的保藏实验共设三个因子：（1）冷冻保藏时间2个水平；（2）双歧杆菌多糖用量3个水平；（3）冷冻保藏温度2个水平，完全实验共构成2×3×2=12个水平（表1），每个处理重复3次。处理时取约500头秀丽隐杆线虫置于4ml的Eppendorf离心管中，加入含有不同浓度双歧杆菌的保藏液。封口胶密封后置于-20℃和-80℃的低温冰箱中保存60d或120d。水浴解冻后取100μl镜检线虫存活情况，剩下的接种于NGM培养基上于22℃下培养7d。死亡判定：向线虫液中滴入一滴5%氯化钠溶液并镜检，如果显微镜下虫体僵直不动，则视为死亡。

表1 冷冻保藏实验的分组设置

（三）统计分析

使用SPSS26统计软件对线虫死亡率进行方差分析。各因子差异采用正交变换分解平方和。对线虫死亡率数据进行多因素方差分析。采用Duncan’S 多重极差检验法对24个处理间差异进行简单的多重比较。

二、结果与分析

（一）双歧杆菌多糖用量对秀丽隐杆线虫存活率影响

实验结果表明，双歧杆菌多糖用量对秀丽隐杆线虫存活率有显著的影响。不添加双歧杆菌多糖的保护液保藏的秀丽隐杆线虫的平均存活率为2.31%；双歧杆菌多糖用量为20g/l时平均存活率为14.31%；而双歧杆菌多糖用量为40g/l时，平均存活率达到了23.40%。

（二）冷冻保藏时间对秀丽隐杆线虫存活率的影响

保藏时间会对秀丽隐杆线虫的存活率有显著的影响。线虫存活率会随着保藏时间延长而降低。保藏60d和120d的平均存活率分别为14.78%和12.73%。最高存活率分别为43.22%和40.90%。

12个条件实验结果表明，对保藏时间影响最大的因素是双歧杆菌多糖的用量，其次是保藏时间。保藏温度为-80℃且保藏时间为120d的情况下，存活率均大于40%，并且与其他组差异显著，接种到NGM培养基上可以看到大量线虫。因此建议采用处理编号为12（-80℃，多糖用量40g/l，保存120d；虽然存活率最高但是保存时间短）。如图1～3所示。

图1 冷冻时间对存活率的影响

图2 双歧杆菌多糖用量对存活率的影响

图3 12个处理的实验结果

三、结语

前人研究了在不同温度下向多种溶液（水、PBS缓冲液、M9缓冲液等，本实验使用的是M9缓冲液）中加入如DMSO、甘油（本实验使用）等物质来保藏秀丽隐杆线虫的效果，但是很少有人设想双歧杆菌胞外多糖也可能具有类似的功能。本实验结果表明，RH双歧杆菌胞外多糖确实具有类似的功能，而且对秀丽隐杆线虫保藏具有决定性作用。当冷冻保藏温度为-80℃，双歧杆菌多糖用量为40g/l时，就能有效保藏秀丽隐杆线虫120d。

四、回首历史，展望未来

1949年，Polae等人发现了甘油具有保护细胞的作用。1988年，Sulston和他的研究团队发现放置于10%甘油溶液中的秀丽隐杆线虫虫体可以在低温下保存25年以上。我国李有全［8-10］等人在秀丽隐杆线虫冷冻保存方面的研究也取得了很大的突破。周红也在前人的研究成果的基础上通过实验进一步讨论并分析了影响线虫冷冻保存的决定性因素。而在2016年，武文浩［4］建立了秀丽隐杆线虫的冷冻保藏方法，并确立了最佳的冷冻条件。但是以上研究仍然存在各自的局限性。

细胞在低温下能保存更长时间是因为在低温下细胞的生化反应速度会减慢，因此代谢速度降低。而代谢速度的降低又可以减少垃圾物质的排放，然后减少细胞的凋亡和死亡，减轻器官的缺血再灌注损伤等。而且酶在低温下的结构稳定，不易失活。但是低温对细胞和生物体可能造成的损害是多方面的。主要表现在冰晶损伤、溶液渗透损伤、过冷休克、结构水的破坏、电解质失衡，甚至会导致细胞DNA的破坏［11-13］，于是需要设法减轻低温带来的负面影响。

冷冻保护剂的出现与发展使得如何减轻低温对细胞损害这个问题有了很大的突破，冷冻保护液能够最大限度地减轻低温对细胞的损伤。目前常用的冷冻保护剂有甘油、甲醇、DMSO（二甲基亚砜）等，但是这些物质可能会对细胞和生物体带来其他负面影响，甚至具有毒性（DMSO），因此需要改良。

双歧杆菌（Bifidobacterium）属是一种革兰氏阳性的、不运动的、细胞呈杆状的、一段有时呈分叉状的严格厌氧菌属，它们广泛存在于人体的消化道等部位，是非常有用的益生菌。它们在人体内有合成维生素，抑制有害菌等功能，也能产生乙酸、丙酸、乳酸等有机物促进肠道蠕动，并净化肠道环境。双歧杆菌还可以产生胞外多糖，EPS有中性和酸性两种，EPS能够抗氧化、抗肿瘤、调节动物的肠道菌群和免疫，甚至还可以清除毒素［14-15］。但是，目前对EPS 的研究仍然停留在EPS的生产、提取与纯化［16］，以及EPS的理化性质、结构［17］和EPS活性产品的研制等方面［18-20］。尽管甘敏［21］在李胜杰［22-25］等人提供的一些理论基础上通过实验对EPS的益生作用及其机理进行了一些探究，但是双歧杆菌EPS的功能以及其作用机制仍需要进一步的探索。

展望未来，本课题确认了RH双歧杆菌胞外多糖确实具有延长秀丽隐杆线虫冷冻保藏时间的能力，未来可以对双歧杆菌胞外多糖延长生物冷冻保藏能力的原因以及作用机制做更深入的研究，进一步了解双歧杆菌多糖的功能及其机理。