干旱-高温交叉胁迫对水稻幼苗光合特性的影响

余 欣，童 飞，詹 妮，叶 婷，王 琴，叶 辉，武立权，李 娟

(1.安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036；2.安徽农业大学农学院，安徽 合肥 230036；3.安徽农业大学生物技术中心，安徽 合肥 230036)

水稻(OryzasativaL.)是我国最重要的粮食作物之一，各项统计表明，我国水稻种植规模和产量长期位居全国主要农作物前两位；中国既是世界上最大的水稻生产大国，也是最大的消费大国，水稻对我国粮食安全具有重要的战略地位[1]。非生物逆境影响是制约水稻粮食生产的主要限制因子之一。近年来，高温、干旱、洪涝等全球自然灾害频发且规模大，包括中国在内的亚洲国家，水稻种植面积和单产量受极端天气影响而下降的现象普遍存在[2]。双季晚稻秧苗移栽以后正值夏秋高温季节，此时往往高温和干旱交替或同时发生，是晚稻生产的主要限制因子。在水稻栽培生产上，如何将不可抗逆的环境因子加以利用已成为水稻抗逆研究的新方向。关于干旱和高温对水稻生长影响的研究多集中于单一逆境[3-6]或复合逆境[7-9]。越来越多的研究证明，植物受轻度主胁迫影响后可获得对另一种或多种强胁迫的抗性，这种现象被称为交叉耐受性或交叉适应性[10]。如热激处理加强了玉米幼苗对高温、低温、干旱及盐等胁迫的抗性[11-12]；营养期干旱诱导显著提高了小麦孕穗期的抗寒能力[13]；干旱或高温预处理可以增强水稻幼苗对高温或干旱的交叉抗性[14]。有关幼苗期水稻干旱-高温交叉适应性的研究，主要集中在渗透调节物质与活性氧含量、活性氧清除系统相关酶活等生理指标的测定[14]，在水稻叶片光合作用和叶绿体超显微结构方面少有报道。本试验选用水稻品种‘N22’，分析干旱-高温交叉胁迫处理水稻幼苗叶片叶绿素总量、光合生理参数、叶绿素荧光参数以及叶绿体超微结构的变化，探讨干旱-高温交叉胁迫下水稻幼苗光合作用与叶绿体显微结构稳定性的关系，为水稻耐旱耐热品种的选育和逆境栽培提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年5—7月在安徽农业大学生物科技楼人工气候箱中进行。以水稻品种‘N22’(OryzastivaL. spp.Aus. CV., ‘Nagina 22’)为试材，挑选籽粒均匀、饱满的水稻种子，经表面消毒、浸种后置于培养皿中催芽，选取发芽均匀一致的种粒播种于带网格的塑料盆(高30 cm，直径25 cm)中，一盆5粒，一共60盆。置于人工气候箱中(昼/夜温度25℃/20℃，昼/夜光周期12 h·h-1，光照强度3 000 Lux，相对湿度75%)，盆内盛有1/2 Hoagland营养液，营养液每3 d更换1次，待水稻长至三叶一心期时，选取长势基本一致的水稻幼苗进行胁迫处理。

1.2 处理方法

本试验设置正常生长(CK)、单一高温胁迫(Heat stress，H)及干旱-高温交叉胁迫(Drought-heat cross stress，DH)3个处理组，处理中除温度和模拟干旱外，水稻幼苗生长条件均一致。(1)正常生长：人工气候箱昼/夜温度为25℃/20℃，不添加PEG-6000 1/2 Hoagland营养液；(2)单一高温胁迫处理：将人工气候箱昼/夜温度调至38℃/30℃，不添加PEG-6000 1/2 Hoagland营养液，高温胁迫培养3 d；(3)干旱-高温交叉胁迫处理：用含10% PEG-6000 1/2 Hoagland营养液模拟干旱胁迫，溶液水势保持在-0.2 MPa左右，连续干旱胁迫培养3 d后，重新用1/2 Hoagland营养液恢复培育至正常后，转入昼/夜温度为38℃/30℃的人工气候箱中，高温胁迫培养3 d。以上每处理重复3次，每重复5盆。

1.3 叶绿素总量测定

采集水稻幼苗的第2～3真叶，剪碎、混匀后称取0.2 g，加入5 mL 95%乙醇，研磨成匀浆，再加入4 mL 95%的乙醇继续研磨至叶片组织变白，静置3～5 min，将全部匀浆转入10 mL离心管，于室温下4 000 r·min-1离心10 min后收集上清液，再用95%的乙醇定容至25 mL，以95%的乙醇为对照。紫外-可见分光光度计(UV-3600,岛津，日本)分别测定665 nm和649 nm处的吸光值，计算总叶绿素含量(mg·g-1)。

1.4 叶片光合特性测定

选取水稻幼苗第2～3真叶，在上午9∶00—11∶00用便携式光合仪(LI-6400，LI-COR，美国)在内置LED红蓝光源和1 000 μmol·m-2·s-1光合有效辐射参数条件下，测定其净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。

1.5 叶绿素荧光参数的测定

将水稻幼苗暗适应30 min后，选取第2～3真叶，用新型调制叶绿素荧光成像系统(IMAGING-PAM，WALZ，德国)进行叶绿素荧光测定，主要测定指标是实际光能转化效率Y(Ⅱ)。

1.6 扫描电镜观察

挑选水稻幼苗的第2～3真叶，取叶片主叶脉两侧的部分，用刀切成5 mm×5 mm的小方块，置入1.5 mL离心管中，用戊二醛固定。用PBS缓冲液漂洗，用乙醇梯度脱水后用乙酸异戊酯置换。将样品干燥、喷金，用扫描电子显微镜(S4800，日立，日本)观察拍照。

1.7 透射电镜观察

挑选水稻幼苗的第2～3真叶，取叶片主叶脉两侧的部分，用刀切成2 mm×5 mm的小方块，置入1.5 mL离心管中，用戊二醛固定。用PBS漂洗样品，1%锇酸固定，再用PBS漂洗，乙醇梯度脱水，用包埋剂与丙酮混合液渗透，再加热包埋聚合。用超薄切片机(EM UC7，徕卡，德国)切片，切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。用透射电子显微镜(HT-7700，日立，日本)观察拍照。

1.8 数据统计分析

所有数据均为3个以上重复(含3个重复)的平均值加标准误，数据整理使用WPS Excel 2020和SPSS 25.0软件做显著性差异分析，采用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan检验法进行处理间的差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 干旱-高温交叉胁迫对水稻幼苗叶绿素总量和叶绿素a/b比值的影响

高温胁迫会抑制叶绿素合成相关酶的活性，从而降低叶绿素含量。由图1A可知，在H和DH处理下水稻幼苗的叶绿素总量分别为0.37、1.98 mg·g-1，均低于CK的2.07 mg·g-1，分别下降82.15%和4.44%；而DH处理后的水稻幼苗的叶绿素总量较H处理却显著上升(P<0.01)，是H处理下的4.35倍。表明高温胁迫显著抑制了水稻幼苗中叶绿素的合成，导致叶绿素的含量显著下降；而水稻苗期进行干旱预处理，有利于减小后期高温对叶绿素合成的抑制，从而提高叶绿素的含量，增强水稻的光合作用能力，提高水稻的耐热性。由图1B可知，水稻幼苗叶绿素a/b比值在H、DH以及CK中的差异不显著，分别为3.01、3.15和3.07，表明单一高温以及干旱-高温交叉胁迫对叶绿素a/b比值的影响不显著。

注:CK:正常生长；H:单一高温处理；DH:干旱-高温交叉处理，**表示1%水平显著性，下同。

2.2 干旱-高温交叉胁迫对水稻幼苗光合参数的影响

净光合速率能够直接反映植物的光合能力。由表1可知，H处理下水稻幼苗净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)均显著低于CK(P<0.05)，下降幅度分别为66.82%、64.83%、8.23%、66.20%。这说明水稻幼苗对高温胁迫十分敏感，高温胁迫导致水稻叶片气孔导度显著减小，从而阻止了CO2的供应，使胞间CO2浓度减小，净光合速率下降。DH处理下，水稻幼苗Pn、Gs、Ci、Tr较H处理显著上升(P<0.05)，分别是H处理的2.67、3.20、1.17、3.46倍；与CK相比，除Pn略低于CK外，Gs、Ci及Tr较CK有小幅度上升，表明水稻苗期进行干旱预处理可以提高水稻对高温胁迫的适应性，保证水稻叶片正常光合作用的同时，增强了水稻幼苗的抗热性。

表1 干旱-高温交叉胁迫对水稻叶片光合参数的影响

2.3 干旱-高温交叉胁迫对水稻幼苗叶绿素荧光参数的影响

高温会破坏叶片PSII，通过检测叶绿素荧光可以了解植物的光合状况，其参数变化可以用来评价植株的抗逆性。由图2可知，H处理下水稻幼苗叶片叶绿素荧光参数Y(Ⅱ)显著低于CK(P<0.01)，下降幅度为27.51%。说明高温逆境显著影响了水稻幼苗光合作用器官活性，从而使得其实际光能转换效率受到抑制。而DH处理下水稻幼苗叶片Y(Ⅱ)略低于CK，差异不显著，但显著高于H处理(P<0.01)，是H处理的1.23倍。表明水稻苗期进行干旱预处理，提高了高温胁迫下水稻幼苗光合作用系统活性，干旱-高温交叉胁迫后的水稻幼苗抗热性会更强。

图2 干旱-高温交叉胁迫对水稻叶片实际光化学量子效率的影响

2.4 干旱-高温交叉胁迫对水稻幼苗叶片超微结构的影响

利用扫描电镜观察水稻叶片表皮气孔形态(图3)。H处理使气孔大小和气孔开度均明显减小，气孔呈近乎闭合状态；而DH处理后气孔大小无显著变化，气孔开张度略大于CK，保持正常的气孔形态。说明水稻苗期进行干旱预处理，可以通过调节气孔大小和形态来提高其光合作用能力和蒸腾能力，以抵御后期高温的胁迫。

注：×6.0 k表示放大倍数为6 000倍。

利用透射电镜观察水稻叶片叶肉细胞(图4)。CK组的叶肉细胞形状完整饱满，叶绿体呈扁平的椭圆状，内部基粒片层稳定排列；而H处理组的叶肉细胞压缩变形，叶绿体膨胀，基粒片层普遍出现断裂甚至解体；DH处理组的叶肉细胞形状保持相对完整，叶绿体与CK组相似，呈扁平的椭圆状，基粒片层结构也相对稳定，无明显断裂和解体。水稻苗期进行干旱预处理，有利于维持叶肉细胞及亚细胞器的正常形态，免受后期高温的伤害。

注：MC：叶肉细胞，Ch：叶绿体，G：叶绿体基粒。×3.0 k、×15 k表示放大倍数为3 000倍、15 000倍。

3 讨 论

光合作用直接影响到水稻产量，而叶片是水稻进行光合作用的主要部位，叶片的生长发育状态关乎水稻光合作用能力的大小，也决定收获后的生物量和产量。水稻幼苗期以营养生长为主，不利的环境因子会左右其发育状况。Pandey等[15]和Bunnag等[16]等研究表明，营养生长期的水稻幼苗若长期处于高温或干旱环境下则会影响其分蘖发生，进而导致有效穗数减少，严重影响水稻的品质和产量。杨波等[17]研究也指出水分和高温复合胁迫下，水稻幼苗光合生理特性会受到显著影响。利用植物的交叉适应性可以成为改良水稻抗逆性的有效手段之一。前人的研究已经表明，对幼苗期水稻进行干旱或高温锻炼，使渗透调节物质积累，明显提高了活性氧的清除能力，增强了水稻的抗热性或抗旱性[14]，但干旱-高温交叉胁迫对水稻光合性能指标的影响鲜有报道。由此可见，进一步从水稻光合作用及叶绿体超微结构入手，探究干旱-高温交叉适应性下水稻幼苗的光合生理响应机制具有重要意义。

3.1 干旱-高温交叉胁迫对水稻幼苗叶绿素的影响

高等植物细胞中光合色素以叶绿素a和叶绿素b为主，它们在光合作用中发挥着吸收和传递光能的作用，反映出水稻幼苗的生长状况和光合作用能力[18]。高温胁迫主要影响叶绿素中间产物合成，从而导致叶绿素合成减少。在一定范围内，增加叶绿素含量可以增强叶绿体对光能的吸收与转化，叶绿素a/b比值反映叶绿素a与叶绿素b对逆境胁迫的敏感性以及逆境胁迫对二者的伤害程度[19]。本研究中单一高温胁迫下水稻叶绿素含量显著降低，但干旱-高温交叉胁迫下水稻叶绿素含量明显高于单一高温胁迫后的水稻，说明单一高温胁迫下水稻幼苗叶绿素合成被抑制，造成了叶绿素含量显著下降；而当水稻幼苗经过适度干旱锻炼后，后期高温对其叶绿素合成的抑制会显著减弱，叶绿素含量也明显上升，增强了光能的吸收和转化能力，从而提高了水稻幼苗对高温胁迫的适应性。但本研究中各处理间叶绿素a/b比值变化不显著，说明叶绿素a和叶绿素b对单一高温以及干旱-高温交叉胁迫有相似的敏感性。

3.2 干旱-高温交叉胁迫对水稻幼苗光合参数的影响

光合作用是植物功能中最敏感的部分，热胁迫降低了植物的光合作用[20]。宋丽莉等[21]研究指出，水稻幼苗在30℃～35℃高温区间表现为Pn、Gs、Ci、Tr等主要光合参数指标有下降趋势，与本研究高温组试验结果一致，而干旱-高温交叉胁迫后水稻幼苗的生理参数与正常生长组的参数差异不显著，表明干旱锻炼能够使水稻幼苗在后期高温胁迫时通过维持适度的气孔导度、正常的CO2的供应，从而保持适应高温环境压力下生存的光合作用强度，进一步验证了水稻幼苗的干旱-高温交叉适应性。

3.3 干旱-高温交叉胁迫对水稻叶片叶绿素荧光参数的影响

实际光能转换效率Y(Ⅱ)指的是原初反应中光系统Ⅱ(PSⅡ)吸收的光能转换为电能的利用率，常作为研究环境胁迫对植物光合能力影响的重要指标之一[22-24]。正常生长状态下，任何植物叶片的荧光参数是不会发生改变的，而当遭受外界逆境胁迫时才会变化以缓解外界伤害。一般来说，胁迫程度越大，PSⅡ受损伤情况越严重，进而导致相应的光化学反应效率显著下降，若植物的抗逆性较强则会表现出其参数下降幅度小[25]。杨卫丽等[26]研究指出，复合体PSⅡ受限是造成高温胁迫后水稻光合速率下降的主要环节。本研究同样表明，高温胁迫下水稻光系统Ⅱ对光能的捕获及转换功能受阻，造成光能利用率的极大损耗，而干旱锻炼使水稻幼苗在应对高温时光能转换的损失降到了最小，为光合作用的维持提供了保障，但关于PSⅡ组成部分受胁迫影响的具体机制仍有待进一步探索。

3.4 干旱-高温交叉胁迫对水稻叶片超微结构的影响

气孔是水稻等大多数植物与外界O2、CO2、水蒸气等气体进行交换的一种特殊结构，用来调节植物光合作用、蒸腾作用。本研究中，高温处理后的水稻气孔大小和气孔开度发生了显著变化，高温会使叶片气孔发生关闭，这一现象在葡萄树幼苗等其它单子叶植物中也发生[22]，而干旱-高温交叉胁迫下气孔则维持正常的生理状态，其中气孔开度略有增大，一方面可能是水稻气孔增大有助于对CO2的吸收，从而补充卡尔文循环中CO2原料的供应，维持光合作用的稳定运作。另一方面，气孔开度变大也会加强叶片的蒸腾作用，降低水稻表面温度，缓解高温伤害。

叶绿体超微结构的变化被认为与光合器官的生理、生化和功能适应性变化密切相关[27]，找出叶绿体变化与光合作用间联系则是说明水稻在干旱-高温交叉胁迫下表现交叉适应性的论证之一。我们观察到水稻幼苗细胞在高温胁迫后出现了明显的损伤，尤以叶绿体结构变化最为突出，其次为细胞形态，基粒片层断裂是叶绿体受高温胁迫后的普遍特征，这一变化与水稻受到盐胁迫后的表现类似，盐胁迫下的水稻幼苗叶片出现了基粒和基质片层瓦解。与高温组对比，干旱预处理组的水稻幼苗叶绿体结构相对完整、基粒片层较规整、基粒间连接较稳定，表明叶绿体整体结构稳定是水稻在高温胁迫下依然保持合适光合作用的关键。

4 结 论

本研究通过对干旱-高温交叉胁迫处理下水稻幼苗叶片叶绿素总量、光合生理参数、叶绿素荧光参数以及叶绿体超微结构变化的分析表明：水稻幼苗在响应干旱-高温交叉胁迫过程中，通过维持正常的叶绿素含量、稳定的叶肉细胞及亚细胞器结构和适度的气孔开度，缓解后期高温对其光合作用能力的破坏，从而减小高温对水稻幼苗生长的伤害，提高了水稻幼苗的耐热性。试验从光合生理响应角度初步探讨了水稻交叉适应性可能的机制，但水稻交叉适应性是一个涉及到基因、蛋白质、代谢物等复杂的分子生化调控网络，其机制还需要从基因组、蛋白组及代谢组等多组学角度更加深入地探究。