基于建立成分活性权重函数的当归酒炙工艺评价研究

王 莹，孙嘉辰，李 霞，高文远, 4*

基于建立成分活性权重函数的当归酒炙工艺评价研究

王 莹1，孙嘉辰2，李 霞3，高文远3, 4*

1.太原科技大学化学与生物工程学院，山西 太原 030024 2.天津商业大学，天津 300134 3.天津大学天津市现代药物传递及功能高效化实验室，天津 300072 4.青海民族大学药学院，青海 西宁 810007

考察文火120 ℃和中火150 ℃酒炙当归的过程中成分与凝血酶抑制活性随时间的变化规律，建立成分与活性的权重函数，确定最佳酒炙工艺。采用HPLC对样品中阿魏酸、5-羟甲基糠醛、对香豆酸、-藁本内酯、咖啡酸、绿原酸、山柰酚、香草醛、原儿茶酸、香草酸、茴香醛11种成分进行定量分析，采用凝血酶抑制活性测定样品的活血活性，决定系数（2）表示单体化合物的贡献率。在炮制12～28 min的过程中，阿魏酸、绿原酸、香草醛、5-羟甲基糠醛和藁本内酯的含量均先增加后降低，其他6种成分的含量没有明显的变化趋势。120 ℃制备的酒当归凝血酶抑制活性高于150 ℃制备的样品，藁本内酯的贡献率最高（2＝0.643 2），其次为阿魏酸。成分群和凝血酶抑制活性的权重函数为W＝ 2.6351＋107.2004－40.85011。确定了120 ℃炮制20 min为最佳炮制工艺，验证了传统炮制中采用文火炮制的科学性，建立了一种能够通过简单测试初步评估当归及其炮制品整体质量的方法。

当归；酒炙；凝血酶抑制活性；权重函数；活血活性；阿魏酸；5-羟甲基糠醛；对香豆酸；-藁本内酯；咖啡酸；绿原酸；山柰酚；香草醛；原儿茶酸；香草酸；茴香醛

当归为伞形科植物当归(Oliv.) Diels的干燥根，具有补血活血的功效，可用于调经止痛，广泛应用于中药配伍[1]。酒当归的活血作用增强，作为当归的主要炮制品被历版《中国药典》收录。酒当归的品质与其炮制温度及炮制时间息息相关，在传统炮制理论中，将炮制分为文火（80～120 ℃）、中火（120～150 ℃）和武火（220 ℃）[2]。当归中挥发性成分含量较高，《中国药典》及各省饮片炮制标准中酒当归均采用文火炮制。中药饮片多成分、多靶点的特征使其质量标准难以参考化学药的标准建立，即仅通过一种有效成分难以实现质量标准与生物效价的统一。中药饮片中多成分之间的互相影响也导致了量效关系的复杂性[3]。因此，选择中药饮片的活性成分群，开展活性成分-药效的综合评价，才能更好地评价中药饮片的生物有效性。

目前，酒炙工艺的关键参数仍缺乏数据化，采用文火炮制的科学性没有得到证实，同时缺乏成分-药效集于一体的质量评价。因此，本实验主要考察酒当归在文火120 ℃和中火150 ℃炮制时成分及凝血酶抑制作用随炮制时间的变化，建立成分-药效的权重函数，阐明炮制机制，为建立科学的质量评价标准奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200 HPLC/6310 MS高效液相色谱-质谱联用，美国安捷伦科技公司；HPLC-PAD，岛津LC-2030C 3D系统控制器；Sunrise酶标仪，瑞士Tecan公司；RE-200A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；CP225D型十万分之一电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；SN2105T型电磁炉，美的集团有限公司；KQ-500E型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；H1650型离心机，湖南湘仪有限公司；ZNHW型智能恒温数显电热套，上海弘懿仪器设备有限公司。

1.2 材料

对照品葡萄糖（批号110833-201205）、没食子酸（批号110831-201204）、藁本内酯（批号111737- 201305）、阿魏酸（批号110773-201614）、绿原酸（批号110753-201415）、咖啡酸（批号110885-200102）、香草酸（批号110776-200402）、香草醛（批号100491-201902）、原儿茶酸（批号110809-201205）、对香豆酸（批号140711-200702）、山柰酚（批号110861-201310）、茴香醛（批号100147-200302）、5-羟甲基糠醛（5-HMF，批号111626-201308），质量分数均≥98%，购自中国食品药品检定研究院。甲醇、磷酸、冰醋酸、浓硫酸、苯酚、Na2CO3购自天津江天有限公司；色谱乙腈购自天津康科德公司；人原凝血酶、发光底物S-2238、福林酚购自美国Sigma-Aldrich公司；黄酒购自浙江塔牌绍兴酒业有限公司。

当归饮片，批号YN-1-1，购自甘肃天士力中天饮片厂，经天津大学生药学科苏艳芳教授鉴定为伞形科当归属植物当归(Oliv.) Diels新鲜根茎的炮制加工品，经检测符合《中国药典》2020年版质量要求。

2 方法与结果

2.1 酒当归样品的制备

取当归饮片2份（各1000 g），各喷洒黄酒100 g并拌匀，闷润1 h[1]。置于炒药锅中，温度分别设置为120 ℃和150 ℃，预热后炒制，在炮制12～28 min时每2 min取出约30 g样品，置晾药盘内放凉。每个样品平行制备3份，粉碎机分别粉碎后，过60目筛，常温保存，备用。

2.2 总酚酸含量的测定

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末0.1 g，加入5 mL 70%甲醇，超声提取30 min，放冷，离心，残渣再加入5 mL 70%甲醇，超声提取30 min，放冷，离心后合并上清液。上清液用70%甲醇定容于10 mL量瓶中，摇匀后4 ℃保存，用于总酚和11种单体化合物的测定。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定没食子酸对照品适量，加70%甲醇超声溶解，配制质量浓度为0.4 mg/mL的溶液，分别精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL置于1 mL量瓶中并用70%甲醇定容，摇匀备用。

2.2.3 测定方法 参考Chen等[4]建立的方法进行总酚含量的测定。取对照品溶液（50 μL）和Folin- Ciocalteau试剂（15 μL）混匀，3 min后加入Na2CO3溶液（10%，75 μL）和蒸馏水（100 μL）混匀后静置20 min，于765 nm处测定吸光度（）值。70%甲醇溶液作为空白对照。以没食子酸对照品质量浓度为横坐标（），值为纵坐标（）绘制标准曲线，得回归方程为＝0.042 3＋0.068 7，2＝0.996 7。样品测试方法同上，结果以没食子酸当量表示。制备的酒当归样品中总酚含量多高于当归。在炮制温度为120 ℃和150 ℃时，总酚含量均随炮制时间的增加先升高后降低，分别在炮制22 min和24 min时含量最高，如图1-a所示。

2.3 总多糖含量的测定

2.3.1 供试品溶液的制备 准确称取样品粉末0.5 g，置圆底烧瓶中，加蒸馏水20 mL，加热回流1 h并滤过，如上操作重复提取1次，合并2次滤液置于50 mL量瓶中，并用蒸馏水定容，摇匀备用。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥后的葡萄糖对照品10 mg，加蒸馏水溶解并定容到100 mL量瓶中。摇匀后分别精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于1 mL量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，备用。

图1 120 ℃和150 ℃当归酒炙过程中总酚(a) 和总多糖(b) 含量的变化

2.3.3 测定方法 供试品溶液稀释100倍后按照苯酚-硫酸法进行总多糖含量的测定[4]，用蒸馏水配制6%苯酚溶液。取葡萄糖对照品溶液20 μL，6%苯酚溶液20 μL和浓硫酸100 μL混匀后在70 ℃水浴中保温10 min，冷却后于490 nm处测定值，蒸馏水作为空白对照，以葡萄糖对照品质量浓度为横坐标（），值为纵坐标（），绘制标准曲线，得回归方程为＝0.005 9＋0.024 7，2＝0.998 8，样品总多糖含量按回归方程计算。当归酒炙过程中总多糖含量的变化趋势如图1-b所示。炮制温度为120 ℃和150 ℃时，酒当归中总多糖含量均随炮制时间的增加先升高后降低，在炮制18 min时含量最高，炮制时间超过24 min时含量低于当归样品。

2.4 化合物的定性和定量测定

2.4.1 化合物的定性分析 采用Agilent 1200 HPLC/6310 MS高效液相色谱-质谱联用仪结合文献报道对“2.2.1”项中制备的当归70%甲醇提取物定性分析，质谱为电喷雾离子源，分别在正离子（3.0 kV）和负离子（−2.5 kV）模式下扫描：喷雾气压0.20 MPa，样品锥孔电压30 V，毛细管电压4.0 kV，离子源温度100 ℃，干燥气温度300 ℃，质量范围/100～1000，梯度洗脱条件与HPLC相同。通过LC-MS结合文献报道[5-7]对当归中化学成分进行定性分析，总离子流图如图2-a、b所示，分析结果如表1、2所示。LC-MS正离子模式大致推断出19个化合物可能的结构信息，主要为挥发油类；负离子模式大致推断出19个化合物可能的结构信息，主要为酚酸类；阿魏酸在正、负离子模式下均出峰。

2.4.2 11种单体化学成分的定量分析

（1）供试品溶液的制备：为“2.2.1”项中制备的70%甲醇提取物。

（2）对照品溶液的制备：取11种对照品适量，精密称定，分别置于棕色量瓶中，加70%甲醇制成藁本内酯、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、香草醛、原儿茶酸、对香豆酸、山柰酚、茴香醛、5-羟甲基糠醛质量浓度分别为0.167、0.235、0.286、0.342、0.333、0.165、0.146、0.299、0.370、0.166、0.260 mg/mL的溶液，保存于4 ℃，备用。

（3）测定方法：按照陈健等[8]建立的方法进行定量分析。采用岛津LC-2030C 3D系统，配备Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相，梯度洗脱：0～10 min，3%乙腈；10～20 min，3%～10%乙腈；20～35 min，10%～20%乙腈；35～70 min，20%～30%乙腈；进样量10 μL；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；在280、316 nm波长处同时检测。

图2 当归70%甲醇提取物负离子(a)和正离子(b)模式下的总离子流图

表1 MS/MS负离子模式鉴定当归中化学成分

表2 MS/MS正离子模式鉴定当归中化学成分

当归样品在波长为280、316 nm时的HPLC图谱如图3所示。采用外标法对其中的11种化学成分进行定量分析。文火和中火2个炮制温度下，阿魏酸、绿原酸、香草醛、5-HMF和藁本内酯的含量均先增加后降低，如图4-a、b所示。对香豆酸、咖啡酸、山柰酚、香草酸、原儿茶酸、茴香醛6种成分在120、150 ℃炮制过程中含量没有很明显的变化趋势，如图4-c、d所示。

2.5 凝血酶抑制活性的测定

2.5.1 供试品溶液的制备 精密量取“2.2.1”项中制备的70%甲醇提取液5 mL，置于50 ℃旋蒸蒸干后，准确量取50 μL DMSO溶解置于5 mL量瓶中，加入蒸馏水清洗并定容，摇匀后备用。

1-5-羟甲基糠醛 2-原儿茶酸 3-茴香醛 4-绿原酸 5-香草酸 6-咖啡酸 7-对香豆酸 8-阿魏酸 9-山柰酚 10-Z-藁本内酯 11-香草醛

图4 阿魏酸、香草醛、绿原酸(a)及5-HMF、Z-藁本内酯(b)在炮制过程中含量的变化以及对香豆酸、咖啡酸、山柰酚、香草酸、原儿茶酸、茴香醛在120 ℃(c)和150 ℃(d)炮制过程中含量的变化

2.5.2 测定方法 按照Chuang等[9]建立的方法，用0.9% NaCl水溶液配制凝血酶（1 mg/mL）及发光底物S-2238（10 mg/mL），样品倍数稀释6个质量浓度。分别精确量取各质量浓度样品溶液150 µL和凝血酶溶液30 µL加入96孔板中混匀。于25 ℃水浴中孵育10 min后加入75 µL S-2238溶液，继续孵育10 min，于405 nm处测定其值。0.9% NaCl代替酶溶液作空白对照，抑制活性按公式（1）计算。

抑制率＝1－样品/空白（1）

空白为空白对照溶液的值，样品为当归提取物的值

凝血酶抑制活性以pIC50［pIC50＝−lg(IC50×0.001)，IC50值为抑制率达到50%时，化合物的质量浓度］值来表示，结果如图5所示。当归的pIC50值为1.585，随炮制时间的延长，酒当归的pIC50值均先增加后减少，分别在炮制18 min和20 min时pIC50值最高。

图5 当归及120、150 ℃炒制过程中酒当归的凝血酶抑制活性

2.6 综合评价模型的建立

按照Chen等[10]建立的方法，以pIC50值最大的样品作为阳性对照，通过2，及其他样品中各化合物浓度与阳性对照样品中该化合物质量浓度的比值计算得到权重（W）。以pIC50值为横坐标，W为纵坐标作图得到线性回归方程，样品中各成分的权重系数及加权方程如公式（2）所示。

W＝＝×pIC50＋（2）

2为权重系数，即单体化合物和凝血酶抑制活性的决定系数；C为各化合物质量浓度；C为凝血酶抑制活性最强的样品中各化合物质量浓度；为化合物的个数

采用相关系数检验法对表3中化合物质量浓度与pIC50值拟合得到的一元线性方程进行回归效果检验，样品个数为19，α＝0.05时，阿魏酸、藁本内酯、茴香醛的质量浓度与pIC50值所得的经验公式有意义。因此，权重与单体化合物质量浓度的关系如公式（3）所示。

W＝2.6351＋107.2004－40.85011（3）

1为阿魏酸质量浓度，4为藁本内酯质量浓度，11为茴香醛质量浓度

如表3所示，以pIC50值为横坐标，W为纵坐标确定当归样品的凝血酶抑制活性综合评价模型为W＝0.411 8 pIC50－0.579 9，2＝0.701 2（公式4）。权重与pIC50值的拟合方程相关系数＝0.837 4（＜0.01），说明得到的经验公式有意义。已知当归中藁本内酯、阿魏酸和茴香醛的质量浓度，可以通过公式（3）计算得到权重值，再用公式（4）计算样品凝血酶抑制活性，即IC50值。

表3 化合物的质量浓度及权重与pIC50值的拟合方程

3 讨论

3.1 总酚、总多糖含量变化分析

炮制过程中的高温会破坏当归的细胞结构使酚类物质不断溶出，结合酚类发生水解成为游离酚使总酚含量增加[11]。酚类物质在持续的高温下难以保持稳定的化学结构，如绿原酸和3,5-二咖啡酰奎宁酸均会被水解为咖啡酸[12]。结果表明，酒当归中总酚含量高于当归，150 ℃制备的酒当归其含量低于120 ℃。

酒当归的总多糖含量高于当归，在2个炮制温度下均随炮制时间的增加先升高后降低，在炮制18 min时总多糖含量均达到最高，分别为25.89%和24.11%。以120 ℃炮制过程中总多糖含量随炮制时间的变化趋势为例进行分析，发现在炮制12 min时总多糖含量低于当归，主要是由于细胞中半纤维素和木质素的结构不稳定发生降解，如橡木蒸制后总多糖含量下降，最高可下降36%[13]。在炮制12～18 min，总多糖含量随炮制时间的延长而增加，主要是由于高温使细胞壁被破坏而释放出多糖[14]。长时间的高温使多糖发生降解且部分多糖的碳化都会使多糖含量下降。在150 ℃炮制时更有益于多糖的快速溶出使得其总多糖的含量略高于120 ℃制备的酒当归。

3.2 11种单体化合物的定量分析

在120、150 ℃炮制时，阿魏酸含量均先增加后降低。阿魏酸可与阿拉伯木聚糖形成酯键结合于细胞壁，加热使酯键断裂，游离的阿魏酸含量逐渐增加。同时，当归中含有的阿魏酸松柏酯性质不稳定，高温条件下易转化为阿魏酸与松柏醇[15]。阿魏酸含量分别在炮制超过24、22 min时有所降低，说明继续加热其结构被高温破坏。文献报道阿魏酸在光照或升温时均会发生降解[16]。

香草醛含量随炮制时间的延长呈先升高后降低的趋势，均高于当归，是由于木质素在高温时可降解生成香草醛。木质素最佳降解温度为240～280 ℃[17]，因此150 ℃炮制时香草醛含量增加更快。绿原酸含量变化与前两者有相同趋势，其含量增加主要是结合态转化为游离态，如大量的共轭酚和结合酚水解，而后的降低则是加热过程中发生水解和分子内酯基的迁移而异构化[11]。

5-HMF是由葡萄糖或果糖在加热过程中脱水生成的，因此含量会随炮制温度的升高和时间的延长而增加。在150 ℃炮制28 min时5-HMF含量降低，是由于其分子中含有的醛基和羟甲基可发生酯化、聚合和水解，分解为乙酰丙酸和甲酸[18]。藁本内酯的含量降低，主要是发生聚合反应形成了二聚体，而在炮制18 min时藁本内酯含量有一定增加，可能是二聚体水解[19]。

3.3 凝血酶抑制活性分析

随着炮制时间的延长，酒当归的pIC50值均先增加后减少，分别在炮制18、20 min时pIC50值较高，主要是由于此时阿魏酸及藁本内酯的含量均较高。120 ℃炮制条件下的酒当归凝血酶抑制活性高于当归，而150 ℃炮制条件下的酒当归多低于当归。文献报道酒炙会减少总挥发油的含量，但是挥发油中藁本内酯的相对百分含量增加[19-20]。

从图5可以看出对凝血酶抑制活性的贡献率从高到低依次为-藁本内酯、阿魏酸，说明阿魏酸、藁本内酯是当归活血作用的主要活性成分，茴香醛含量与凝血酶活性呈负相关性。其他8种化合物含量与凝血酶抑制活性的决定系数2均较小，没有显著相关性。姚艺新[21]通过灰色关联度分析发现川芎中藁本内酯、洋川芎内酯和阿魏酸与活血活性之间有较高的关联系数。

当归具有补血活血的功效，酒炙后活血活性增强，与其酚酸类、多糖类成分相关。前期考察了多糖对凝血酶活性的影响，发现抑制率较低，而且可能是物理包埋作用，使得酶活位点难以发挥作用[22]。多糖的活血作用可能主要表现在提高造血能力、抗血小板聚集方面，需要进一步实验验证。本实验考察了当归及120、150 ℃分别炮制12～28 min制备的酒当归共19个样品的成分含量和凝血酶抑制活性的变化。本实验验证了传统炮制中采用文火炮制的科学性，发现藁本内酯、阿魏酸是发挥活血作用的主要成分。炮制条件对于结合态阿魏酸到游离态的转变，及阿魏酸松柏酯分解为阿魏酸均有较大影响，因此，仅以阿魏酸含量为指标难以完整地反映当归整体质量特征。

本实验解释了炮制过程中主要成分含量和凝血酶抑制活性的变化规律，建立了成分与凝血酶抑制活性的权重函数，使通过测定成分含量来计算当归及其炮制品的凝血酶抑制活性成为可能，解决了用1种小分子成分难以综合评价中药饮片质量的问题。通对药效物质基础的初步研究，为当归和酒当归质量的有效评价提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quantitative evaluation ofRadix processed with yellow wine based on composition-activity weight function method

WANG Ying1, SUN Jia-chen2, LI Xia3, GAO Wen-yuan3, 4

1.School of Chemical and Biological Engineering, Taiyuan University of Science and Technology, Taiyuan 030024, China 2.Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China 3.Tianjin Key Laboratory for Modern Drug Delivery and High-Efficiency, Tianjin University, Tianjin 300072, China 4.College of Pharmacy, Qinghai Minzu University, Xining 810007, China

To investigate the changes of ingredients and thrombin inhibitory activity in the process of wine-roasting Danggui () at 120 ℃and 150 ℃.The weight function of the ingredients and the activity was established, as well as the best roasting process was determined.Quantitative analysis of 11 components in samples, including ferulic acid, 5-hydroxymethylfurfural,-coumaric acid,-ligustilide, caffeic acid, chlorogenic acid, kaempferol, vanillin, protocatechuic acid, vanillic acid, and anisaldehyde, was carried out by HPLC.Thrombin inhibitory activity was used to evaluate the bioactivity of the samples.The values of determination coefficient (2) represented the contribution rate of compounds.During the processing of 12—28 min, the contents of ferulic acid, chlorogenic acid, vanillin, 5-hydroxymethylfurfural and-ligustilide increased first and then decreased, and the others had no obvious trend.Thrombin inhibitory activity ofwine-roasted at 120 ℃ was higher than that of the sample roasted at 150 ℃.The contribution rate of-ligustilide was the highest (2= 0.643 2), followed by ferulic acid.The weight function of compounds and thrombin inhibitory activity was shown asW= 2.6351+ 107.2004－40.85011.The best processing technology was wine-roasted for 20 min at 120 ℃, which verified the scientific of processing with gentle fire in the traditional method.This study established a simple method to evaluate the quality ofand its processed products in the first-level test.

(Oliv.) Diels; stir-frying with yellow wine; thrombin inhibitory activity; weighting function; blood activating activity; ferulic acid; 5-hydroxymethylfurfural;-coumaric acid;-ligustilide; caffeic acid; chlorogenic acid; kaempferol; vanillin; protocatechuic acid; vanillic acid; anisaldehyde

R283.1

A

0253 - 2670(2022)10 - 3014 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.011

2021-11-24

天津市科技计划项目（19YFZSY00170）；青海省科技计划项目（2021-SF-150）；来晋工作优秀博士奖励基金（20212018）；太原科技大学科研启动基金（20202067）；山西省高等学校科技创新项目（2021L337）

王 莹（1988—），女，博士，研究方向为中药炮制。Tel: 17835114050 E-mail: wangyingwangxing11@163.com

通信作者：李 霞，教授，博士生导师，主要从事中药炮制、中药化学研究。Tel: (022)87401895 E-mail: lixia2008@tju.edu.cn

高文远，教授，博士生导师，主要从事中药资源、中药炮制、中药化学研究。Tel: (022)87401895 E-mail: pharmgao@tju.edu.cn

[责任编辑 郑礼胜]