子宫平滑肌肉瘤组织EphA2/EphrinA1表达及沉默EphA2对肿瘤细胞生长与RelA/p65磷酸化的影响*

邓卉 陈晓燕 严园 魏征 肖凤莲 余晓

(1. 重庆市中医院妇科，重庆 400011；2. 重庆市九龙坡区妇幼保健院妇产科，重庆 400051)

子宫平滑肌肉瘤是较罕见的妇科泌尿生殖道恶性肿瘤之一。据统计，仅有2%～5%的子宫恶性肿瘤是子宫平滑肌肉瘤，但由于其侵略性较强，且治疗方法有限，因此死亡率较高[1-3]。生促红素肝细胞受体A2(Erythropoietin-producing hepatocyellular receptor A2，EphA2)属于受体酪氨酸激酶超家族中最大的亚家族-Eph受体，EphA2及其配体EphrinA1与多种恶性肿瘤的形成和进展相关，两者在肿瘤细胞中存在过表达的现象[4-5]，且还有研究表明EphA2表达的增加与患者预后不良以及肿瘤转移也相关[6]。鉴于此，本研究通过检测EphA2和EphrinA1在子宫平滑肌肉瘤中是否存在异常表达，进而利用siRNA技术沉默EphA2表达以观察其对子宫平滑肌肉瘤细胞生物学行为和RelA/p65磷酸化的影响，以期为子宫平滑肌肉瘤的靶向治疗及预后评估的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月～2020年6月在重庆市中医院妇科诊治的子宫平滑肌肉瘤患者共28例作为研究对象，收集术中切除的子宫平滑肌肉瘤样本，对照组为子宫平滑肌瘤组织包膜外正常肌层，即为瘤旁组织。此次研究获得了本院伦理委员批准进行，研究的所有患者均签署了知情同意书。患者年龄 34～54岁，平均(45.47±4.62)岁。所有患者符合子宫平滑肌瘤的诊断标准，以影像学诊断为依据；术前均未经放、化疗及服用激素药物治疗；均无卵巢肿瘤、糖尿病等并发症；临床和随访资料完整。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色检测组织中EphA2与EphrinA1表达 取手术切除的子宫平滑肌肉瘤及瘤旁组织，置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切取5 μm厚的切片。取切片放置在烤箱中66℃处理1 h，接着在二甲苯中脱蜡，梯度酒精脱水，PBS冲洗3次，每次5 min；加入柠檬酸钠进行抗原修复，PBS冲洗3次，每次5 min；取0.3%过氧化氢液滴于切片上，室温孵育10 min；采用10%山羊血清封闭，滴加稀释的一抗(1:100)，4℃孵育过夜。第二天，PBS冲洗后，滴加生物素标记二抗，室温孵育1 h，DAB显色，流水冲洗干净，苏木精复染，中性树胶封片，在光学显微镜下观察组织中阳性表达并捕获图像，胞质染成黄色至棕色即为阳性，随机选择6个视野，Image-Pro Plus软件统计阳性表达面积。

1.3.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EphA2、EphrinA1mRNA表达 Trizol法提取不同组织及各处理组细胞总RNA，紫外分光光度计检测总RNA质量与浓度。选择符合要求的RNA样品，根据反转录试剂盒说明书进行操作，将其反转录合成cDNA，接着以cDNA为模板，通过实时荧光定量检测系统检测EphA2、EphrinA1mRNA表达，具体实验步骤按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行，选择β-actin作为内参基因。扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s(循环40次)。扩增结束后，运用2-ΔΔCt法计算基因的表达水平，引物序列如下：EphA2上游引物5′-TCAGCAGCAGCGACTTCGAGGCA-3′，下游引物5′-GCCATGAAGTGC TCCGTAT -3′；EphrinA1上游引物5′-AACAAGCTGTGCAGGCATGG-3′，下游引物5′-CTCCACAGATGAGGTCTTGC-3′；β-actin上游引物 5′-ATGGTGGGAATGGGTCAGA-3′，下游引物 5′-TCTCCATGTCAGCCAGTTG-3′。

1.3.3 细胞复苏与培养 将冻存的SK-UT-1细胞取出，放入37℃水浴加热，快速摇动使其完全溶解后，以800 rpm离心5 min，除去上清液，加入适量含10%一级胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的培养液，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，2～3天贴壁后换液，融合达到80%左右时，传代，加入0.25%胰酶消化液消化处理，继续培养。

1.3.4 细胞分组与转染 取生长状态良好的SK-UT-1细胞，调整细胞密度为1×106个/mL并接种于96孔板，将细胞随机分为空白对照组、阴性对照组(NC-siRNA)、EphA2-siRNA组3组。按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书操作，分别配制EphA2-siRNA及阴性对照NC-siRNA与脂质体Lipofectamine 2000复合物，在对应组的细胞中加入适量复合物进行转染，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养4～6 h，弃去培养液，换用新鲜培养液继续培养48 h，利用qRT-PCR和western blot检测转染效果。

1.3.5 Western blot检测EphA2与RelA/p65磷酸化位点蛋白表达 在各组SK-UT-1细胞中加入预冷RIPA缓冲液进行裂解，以4000 rpm离心15 min，提取各组样品总蛋白，Bradford法检测蛋白浓度。取40 μg各组蛋白样品等量上样，经过10% SDS-PAGE电泳分离，将分离后的蛋白转移至PVDF膜，室温下置于5%脱脂奶粉中封闭2 h；TBST洗膜3次，每次5 min；加入兔抗EphA2(1:1000)、p53(1:1000)、RelA/p65 Ser536(1:1000)及RelA/p65 Ser276(1:1000)一抗工作液，4℃孵育过夜；第二天，弃去一抗，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(1:5000)，室温孵育1 h；TBST再次洗膜，滴加ECL试剂液显色曝光，凝胶成像系统拍摄蛋白条带图像，Image J软件分析各条带的灰度值，并以β-actin作为内参蛋白来计算目的蛋白表达水平。

1.3.6 CCK-8检测细胞增殖 取生长状态良好的各组SK-UT-1细胞，调整密度为5×55个/ml，吸取100μl接种于96孔板，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱过夜。次日，进行细胞转染处理实验，在转染后24、48、72 h，分别于每孔加10 μl 的CCK-8，轻轻混匀，继续培养4 h后，通过全自动酶标仪检测各孔细胞在450 nm处的光密度(OD)值。

1.3.7 Transwell小室实验检测细胞迁移与侵袭 采用DMEM培养液稀释Matrigel胶，取50 μL稀释的Matrigel胶加入Transwell小室上室聚碳脂膜上，置于37℃培养箱内干燥。取转染后各组SK-UT-1细胞，调整密度为2×104个/ml，取200 μL细胞悬液加入小室上室，并在下室中加入600 μL无血清DMEM培基液，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱孵育24 h，取出小室，弃去培养液，用湿棉签轻轻擦去上室细胞，下室室面用4%多聚甲醛中固定30 min，擦去固定液，加入0.1%结晶紫染色20 min，流水洗掉多余染液，在光学显微镜下随机选择6个视野观察并捕获图像，统计侵袭细胞数目，取平均值为实验结果，实验重复3次。迁移实验除不进行铺胶外，其他操作均与上述过程一致。

风选系统正常运转后，可提高商品煤品类精度，但相应的排矸量也相应增加，势必减少商品煤总量，这就需要进行项目经济性对比分析，从而佐证项目经济性和可行性。经对风选实验时商品煤质量情况进行测定，结合市场价格情况和具体资金投入等进行综合分析计算，来测算项目的经济效益。

1.3.8 TUNEL染色检测细胞凋亡 收集转染后的各组SK-UT-1细胞，PBS冲洗3次，每次5 min，加入4%多聚甲醛固定细胞30 min，加入含0.3% Triton X-100的PBS重悬细胞，室温下继续孵育5 min，接着加入TUNEL检测液，反复吹打混匀，置于37℃避光孵育1 h，PBS洗涤细胞，进行涂片处理后，在荧光显微镜观察随机选择6个视野，计数细胞总数目和TUNEL阳性染色细胞数目，计算TUNEL阳性率。

1.3.9 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集转染后的各组SK-UT-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，PBS冲洗3次，每次5 min，以4000 rpm离心10 min，弃去上清液，用适量染色缓冲液binding buffer中调整细胞密度为 1×106个/mL，吸取100 μL细胞悬液，依次加入10 μL Annexin V-FITC试剂液与5 μL PI溶液，混合均匀，避光室温孵育15 min，立即上流式细胞仪检测各处理组细胞凋亡发生的比例。

1.3.10 免疫荧光染色检测NF-κB p65表达 收集转染后的各组SK-UT-1细胞，PBS冲洗3次，每次5 min，加入4%多聚甲醛固定15 min，滴加含有0.5%TritonX-100的PBS通透处理15 min，PBS再次清洗；采用10%山羊血清封闭细胞2 h，接着加入稀释的兔抗p65抗体(1:200)，4℃孵育过夜；第2天，PBS洗涤后，滴加FITC标记的荧光二抗(1:250)，室温避光孵育1 h，采用DAPI避光孵育5 min染核，PBS洗涤细胞，使用荧光显微镜观察并捕获图像。

2 结果

2.1 子宫平滑肌肉瘤及癌旁组织中EphA2与EphrinA1表达比较 免疫组织化学染色结果所示，EphA2与EphrinA1在子宫平滑肌肉瘤组织中阳性染色较深且面积较多，而两者在癌旁组织中阳性染色面积较少，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图1。qRT-PCR检测结果显示，相较于癌旁组织，子宫平滑肌肉瘤组织中的EphA2与EphrinA1 mRNA相对表达量均显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图1 免疫组化染色检测组织EphA2与EphrinA1表达(100×)Figure 1 Immunohistochemical staining to detect the expression of EphA2 and EphrinA1 in tissues

图2 qRT-PCR检测组织EphA2、EphrinA1 mRNA表达Figure 2 qRT-PCR detection of tissue EphA2，EphrinA1 mRNA expression

2.2 转染后子宫平滑肌肉瘤细胞中EphA2表达变化 qRT-PCR和Western blot检测结果显示，在转染48 h后，EphA2-siRNA组SK-UT-1细胞中EphA2 mRNA与蛋白的相对表达量较空白对照组均显著下调(P<0.05)，而EphA2-siRNA组和EphA2-NC组的EphA2 mRNA与蛋白相对表达量之间差异均无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 qRT-PCR和Western blot检测各组SK-UT-1细胞中EphA2 mRNA及蛋白表达Figure 3 qRT-PCR and Western blot detection of EphA2 mRNA and protein expression in SK-UT-1 cells of each group

2.3 沉默EphA2表达对子宫平滑肌肉瘤细胞增殖的影响 CCK-8检测沉默EphA2表达后对SK-UT-1细胞增殖活性的影响，检测结果显示，相较于空白对照组，EphA2-siRNA组细胞在转染24、48及72 h后，细胞的增殖活性显著下降(P<0.05)，而NC-siRNA组与空白对照组的细胞增殖活性之间差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图4 CCK-8检测各组SK-UT-1细胞增殖活性Figure 4 CCK-8 detects the proliferation activity of SK-UT-1 cells in each group注：与Blank组比较，①P<0.05

2.4 沉默EphA2表达对子宫平滑肌肉瘤细胞迁移与侵袭的影响 Transwell小室实验检测沉默EphA2表达对SK-UT-1细胞迁移与侵袭的影响，见图5。与空白对照组比较，EphA2-siRNA组细胞的迁移数目与侵袭数目均显著减少(P<0.05)，而NC-siRNA组细胞迁移数目与侵袭数目均无显著变化(P>0.05)。

图5 Transwell小室实验检测各组SK-UT-1细胞迁移与侵袭Figure 5 Transwell chamber experiment to detect the migration and invasion of SK-UT-1 cells in each group

2.5 沉默EphA2表达对子宫平滑肌肉瘤细胞凋亡的影响 TUNEL染色检测结果所示，三组SK-UT-1细胞中均有阳性染色，与空白对照组比较，EphA2-siRNA组TUNEL阳性染色细胞率显著增加(P<0.05)，NC-siRNA组TUNEL阳性染色细胞率则无显著变化(P>0.05)，见图6。流式细胞术检测结果显示，与空白对照组比较，EphA2-siRNA组SK-UT-1细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，而NC-siRNA组和空白对照组的细胞凋亡率之间差异无统计学意义(P>0.05)，见图7。

图6 TUNEL染色检测各组SK-UT-1细胞凋亡Figure 6 TUNEL staining to detect the apoptosis of SK-UT-1 cells in each group

图7 流式细胞术检测各组SK-UT-1细胞凋亡Figure 7 Flow cytometry detection of SK-UT-1 cell apoptosis in each group

2.6 沉默EphA2表达对子宫平滑肌肉瘤细胞p65表达的影响 免疫荧光染色结果所示，空白对照组SK-UT-1细胞中p65在核中染色明显，绿色荧光强，NC-siRNA组细胞中p65核染色也较明显，绿色荧光强度与空白对照组相似，而EphA2-siRNA组染色较空白对照组变浅，核内无明显绿色荧光表达，见图8。

图8 免疫荧光染色检测各组SK-UT-1细胞p65表达(100×)Figure 8 Immunofluorescence staining to detect p65 expression of SK-UT-1 cells in each group

2.7 沉默EphA2表达对子宫平滑肌肉瘤细胞RelA/p65磷酸化水平的影响 Western blot检测SK-UT-1细胞中RelA/p65主要活性位点的磷酸化水平，与空白对照组比较，EphA2-siRNA组细胞中p53蛋白表达显著升高(P<0.05)，RelA/p65 Ser536和RelA/p65 Ser276磷酸化蛋白水平显著降低(P<0.05)；而空白对照组和NC-siRNA组以上各蛋白水平表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图9。

图9 Western blot检测各组SK-UT-1细胞中RelA/p65磷酸化位点蛋白表达Figure 9 Western blot detection of RelA/p65 phosphorylation site protein expression in SK-UT-1 cells in each group

3 讨论

子宫平滑肌肉瘤是一种较为罕见的肿瘤，由于临床表现与普通肌瘤相似，因此检测及治疗困难。目前，子宫平滑肌肉瘤的治疗手段包括全腹子宫切除术、双侧输卵管卵巢切除术和使用化疗药物，但患者3年无进展生存率仅为50%。大多数患者在治疗后8～16个月内出现复发，通过血流转移至别处器官，多数复发发生在骨盆外区域，肺是最常见的复发部位[7-9]。导致子宫平滑肌肉瘤的发生发展的尚不清楚，研究表明，在子宫平滑肌肉瘤中涉及了一些基因突变或者表达改变，通过全面的基因组分析已经发现了多种基因的改变，鉴别这些特异性基因蛋白在开发新型针对子宫平滑肌肉瘤的分子靶向疗法中起着十分关键的作用。

Eph受体构成了一个较大的受体酪氨酸激酶家族，其能够通过与聚集在邻近细胞中的Ephrin配体结合，从而介导细胞之间信号传递过程。现已发现EphA2在多种肿瘤组织或细胞中存在过表达现象，并与其配体EphrinA1结合参与调控肿瘤血管生成、侵袭转移、体液稳态以及血管重组等过程[4，10]。本研究结果显示，EphA2与EphrinA1在子宫平滑肌肉瘤组织中的表达水平明显高于瘤旁组织中的表达水平，这提示EphA2及其配体EphrinA1可能参与了子宫平滑肌肉瘤的发生发展。在以往研究中，李黎等[11]通过检测发现在宫颈鳞癌组织中EphA2和EphrinA1呈高表达，且两者表达水平均与宫颈鳞癌的肿瘤分化程度、FIGO分期、淋巴结转移及局部侵润深度相关。Shao等[12]研究发现EphA2/EphrinA1在涎腺腺样囊性癌中高表达，与微血管密度、临床TNM分期、神经周浸润和血管浸润相关，表明了EphA2/ EphrinA1可以作为腺样囊性癌的新型治疗靶点。以上结果说明EphA2及其配体EphrinA1在多种肿瘤中存在异常高表达，并与疾病的发生发展密切相关。

Eph受体家族由两个亚类EphA(EphA1-10)和EphB(EphB1-6)组成。研究发现，EphA2作为该家族成员之一，能够促进肿瘤细胞增殖、转移和上皮-间质转化等恶性生物学过程，其过度表达也与乳腺癌、胃癌、宫颈癌、膀胱癌、鼻咽癌等发生发展以及患者不良预后之间均密切相关[13-18]。考虑到以EphA2为靶点的治疗方法在临床治疗中的应用，本研究通过脂质体介导法将EphA2-siRNA转染至子宫平滑肌肉瘤SK-UT-1细胞以沉默EphA2表达。经检测发现，肿瘤细胞的增殖活性明显下降，细胞迁移与侵袭能力均受到抑制，同时，促进了细胞凋亡的发生。因此推测，以EphA2为靶点的疗法应用于以EphA2表达作为生物标记物的肿瘤进行治疗时，可能会为子宫平滑肌肉瘤患者带来临床益处。

NF-κB是一个普遍存在与表达的转录因子家族，可参与调节细胞生长、存活、应激反应和炎症相关基因的表达[19-22]。NF-κB信号传导途径在两层反应中被激活，IKKB的IKK依赖性磷酸化和降解可以使NF-κB发生核易位，但核易位和DNA结合不足以发挥其最大的转录活性，需要进行复杂的翻译后修饰来调节其反式激活潜力[23]。RelA/p65是NF-κB家族中最重要的亚基，其磷酸化是关键的翻译后激活机制。迄今为止，在RelA/p65中已经鉴定出总共12个磷酸化位点，包括9个丝氨酸和3个苏氨酸位点，其中Ser276和Ser536是RelA/p65中的两个重要的磷酸化位点[24]。Ser276被蛋白激酶A和MSK1磷酸化；而Ser536被IκB激酶、TANK结合激酶(TBK1)和核糖体亚基激酶-1(RSK1)磷酸化。RelA/p65一些相关位点的磷酸化激活可能有助于肿瘤发生发展[25]。本研究结果显示，在沉默EphA2后子宫平滑肌瘤细胞中RelA/p65 Ser536和RelA/p65 Ser276磷酸化蛋白水平均降低，而抑癌因子p53蛋白表达则升高。由此推测，沉默EphA2可能抑制了RelA/p65相关位点的磷酸化，以阻碍肿瘤细胞的生长与转移。

4 结论

在子宫平滑肌肉瘤组织中EphA2及其配体EphrinA1均呈现高表达，沉默EphA2表达可抑制子宫平滑肌肉瘤细胞增殖与转移，诱导细胞凋亡，并调控RelA/p65中Ser276和Ser536位点磷酸化水平。这说明两者联合检测有助于子宫平滑肌肉瘤的诊断与预后评估，可为今后子宫平滑肌肉瘤的靶向治疗提供新思路。