矮抗58×苏隆128的DH遗传群体创建

刘 洋，刘高祥，丁子俊，司宇佳，盛路宁，方 舟，赵维萍，蔡 华

单倍体是指具有配子染色体数的个体，经染色体加倍后，在一个世代中即可获得纯合的二倍体群体，再根据育种目标从群体中选择优良的纯系，其后代不会发生性状分离，表型整齐一致。与常规育种相比，单倍体育种能够极大程度地缩短育种年限，在小麦、水稻、烟草等作物育种中得到了广泛应用[1]。在小麦单倍体育种过程中，获得单倍体最常见的途径是球茎大麦法、花药培养法和玉米杂交法。

早在1984年，Zenkteler就首次报道了以小麦做母本玉米做父本进行远缘杂交获得球形胚的研究[2]。随后，Laurie等初次从细胞学角度证明小麦与玉米杂交所得是杂种胚，研究发现远缘杂交后来自玉米花粉的染色体在最初的三次细胞分裂中会被逐渐地完全排除掉，最后只剩下小麦母本的21条染色体，即产生了小麦单倍体胚[3]。自1988年Laurie等利用小穗培养法首次获得小麦与玉米远缘杂交产生的单倍体植株后[4]，国内外许多学者均进行了有关理论研究和技术改良，并应用于小麦育种实践中[5-6]。利用小麦×玉米诱导小麦产生单倍体的技术具有单倍体诱导效率高、对小麦基因型无严格的选择性、不产生白化苗、诱导产生的单倍体遗传稳定性高和杂交结实率较高等优点[7-10]。本课题组前期以5E008 ×宁麦9号的F1与玉米远缘杂交诱导小麦单倍体，再经染色体加倍获得了DH系，并从中选育出了小麦新品种苏隆128[11]。陈新民等也利用小麦与玉米杂交创制小麦DH群体技术选育出了小麦新品种中麦533[12]。

本研究将矮抗58×苏隆128的F1代小麦植株在开花时与甜玉米杂交，产生单倍体植株，再将单倍体植株进行染色体加倍获得可以稳定遗传的纯合群体，并希望可以获得高抗倒伏，饱满度好，成穗率高，商品性好且高抗赤霉病的遗传群体。

1 材料与方法

1.1 亲本材料

以高抗倒伏、抗冻性强、分蘖多的半冬性中熟品种矮抗58为母本，以抗赤霉病、籽粒优良的春性品种苏隆128为父本进行杂交得到F1代。再以F1为母本，以甜玉米(购自滁州市当地农贸市场)为父本进行远缘杂交。

1.2 小麦种子人工春化及分期播种甜玉米

由于F1的母本矮抗58是一个半冬性品种，其需要低温春化才能正常开花结实。所以为了保证小麦与玉米花期相遇，并保证F1代小麦正常开花结实，于2016年7月先对F1代小麦进行人工春化(4℃低温处理3周左右)，然后从8月起分期播种甜玉米(每周播种1次，连续播种6次)，小麦材料于8月初春化完成后移栽至人工气候室。

1.3 小麦去雄及授粉

2016年9月～11月进行人工去雄与授粉。在小麦开花前2 d～3 d进行人工去雄并套袋隔离；去雄后3 d～5 d内及时授予新鲜甜玉米花粉，甜玉米花粉量充足时可采用“滚粉”法授粉[13]，授粉后仍然需要进行套袋隔离。

1.4 割穗离体培养及田间培养

割穗离体培养法：先按照表1配制混合培养液5 L。在授粉24 h后，齐根部将杂交后的麦穗剪下，将穗的根部插入配制好的混合培养液中，于组培室培养14 d(白天温度 22℃～23 ℃、夜间 16℃～17 ℃、湿度70 %左右、光照为自然散射光)，每天更换培养液1次[14]。

表1 溶质浓度

田间常规杂交法：授粉5 h后在杂交穗最上部茎节内注射约0.5 mL的100 mg/L 2,4-D溶液，24 h后重复注射一次。在授粉后第12d～16d每天采取部分杂交穗[15]。

1.5 胚拯救与幼苗培养

在离体培养(或田间自然生长)14 d后开始进行胚拯救，具体过程如下：①每个膨大的子房用75%的乙醇进行消毒30 s，再用0.1%氯化汞溶液表面灭菌15 min，最后用无菌水冲洗3次；②在洁净工作台内的解剖镜下进行剥胚，将获得的杂交幼胚接种到1/2 MS培养基中。

将接种的幼胚置于4℃冰箱中冷藏2 d，然后移到25℃组培室中遮光培养12d左右，待单倍体幼胚分化出根和茎以后，按每天光照12 h进行培养，直到幼苗长至5cm～8 cm高后移栽至花盆内，并喷洒生长素吲哚乙酸和多效唑[15]。

1.6 单倍体苗的染色体人工加倍

单倍体苗达3个以上分蘖节时，从花盆中取出幼苗，洗净根部，剪去须根，置25 ℃的20 mL/L二甲基亚砜+ 0.05 %的秋水仙素溶液中处理7 h并持续给O2。然后用流动水冲洗12 h后，移栽至田间土壤中。在抽穗后开花前对所有植株逐穗套袋，并观察植株结实情况，最终收获加倍单倍体(Double Haploid，简称DH)种子。

2 结果与分析

2.1 花期调节

为了保证甜玉米与F1代小麦能够花期相遇，本试验分期种植甜玉米，每隔一周种植一批，总共种植6期。表2记录了花期调控的结果，结果表明：8月初人工春化完成后移栽入田间的小麦可与某几个播种期的甜玉米的花期相遇；8月2日播种的甜玉米较8月4日移栽入田间的小麦晚开花4天；10月份的持续阴雨天气导致了玉米开花时间推迟。

表2 花期调节试验统计表

2.2 割穗离体培养与田间自然生长条件下子房的比较

从图1可以看出，割穗离体培养1 d时杂交后的小麦子房就已开始发育，离体培养14 d后小麦子房膨大至可进行胚拯救的状态；而田间自然生长14 d后杂交子房膨大情况仍不甚理想，且多数被霉菌感染，这可能是由于套袋引起子房周围湿度过高导致霉菌生长。从小麦穗取下杂交子房后可以看出无效子房、杂交子房与自花授粉子房有明显差异，无效子房瘪小，杂交子房较饱满，自花授粉子房非常饱满(图1)。

(a)离体培养1 d的子房；(b)离体培养14 d的子房；(c)田间自然生长14 d的子房；(d)上：无效子房；中：杂交子房；下：自花授粉子房

3.3 单倍体胚与自花授粉胚的比较

小麦与玉米远缘杂交产生的单倍体子房内会出现胚乳败亡，仅剩单倍体胚的现象[3]。本试验杂交子房内就表现出无胚乳，且仅有较小的胚(图2)。而正常情况下，小麦自花授粉的子房既有胚又有胚乳，且胚较大(图2)。

(a)无胚乳的单倍体胚；(b)有胚乳的自花授粉的胚

3.4 单倍体幼苗与自花授粉幼苗的比较

单倍体幼苗一般比较纤弱，生长缓慢，高度不育，无法形成种子，本试验研究与其一致。如图3所示，远缘杂交产生的单倍体幼苗较自花授粉幼苗生长缓慢且弱小，相同培养条件下，在培养30d时，单倍体幼苗也仅长出一片叶，而自花授粉幼苗生已长成5～6片叶(图3)。

(a)光照培养2 d的单倍体胚(箭头所示);(b)光照培养30 d的单倍体幼苗;(c)光照培养2 d的自花授粉幼苗;(d)光照培养30 d的自花授粉幼苗

3.5 得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率

杂交穗割穗离体培养和自然生长条件下的得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率结果如表3所示。表3结果表明，割穗离体培养处理在得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率上均要明显高于自然条件下生长的杂交穗，前者的平均得果率比后者高出8.5%，并且后者没有得到单倍体胚和幼苗，这就表明室内割穗离体培养的条件更加有利于单倍体胚的形成和生长发育。最终本试验通过割穗离体培养法获得156株双单倍体植株(图4)。通过统计计算得出总得果率=80.56%,总得胚率=3.28%，总胚成苗率=7.50%，总加倍成功率=66.67%。

表3 得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率统计表

图4 双单倍体遗传群体

3 讨论

在正常的栽培条件下，小麦和玉米的花期总是不遇的。小麦一般在冬季播种，次年春季开花，而冬春季节种植的玉米一般植株比较矮小，花粉量少，育性也较差；玉米一般在夏秋季播种、开花，此时种植小麦会因不能春化而无法抽穗开花，即无法进行授粉。胡冬梅为使小麦与玉米花期相遇，采用玉米温床育苗培养、大田移栽，小麦分期播种的方法来调节花期[16]。本试验采用的则是人工春化小麦然后移栽和分期播种玉米的方法来使小麦与玉米花期相遇。因此，分期播种并配合适当的措施是生产上调节花期常用的方法。

小麦与玉米远缘杂交后杂交穗的培养一般有两种方法：一种是割穗离体培养法，另一种是田间自然生长培养法。顾坚等在研究两种方法下的单倍体胚诱导效果时发现割穗离体培养处理得胚率要明显高于田间自然生长条件下的杂交穗，前者是后者的3.29倍；前者的颖壳结实率也比后者高出20%，且离体培养的颖果要比自然生长条件下的颖果饱满；另外，离体培养形成的单倍体胚要比自然生长形成的单倍体胚大，这都表明室内割穗离体培养更有利于单倍体胚的形成和生长发育[14]。本试验同样采用了上述两种方法，结果与之类似，杂交后14d割穗离体培养子房的膨大程度要高于田间自然生长，并且割穗离体培养处理在得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率上均要明显高于自然条件下生长的杂交穗，最后只在离体培养法中得到了单倍体胚和幼苗。离体培养法比田间自然生长法得胚率高，可能与室外温度变幅较大，而室内温度变幅较小、湿度较稳定有关。而且田间自然生长条件下需要对杂交穗套袋，袋内湿度过高时会导致子房多被霉菌包围，这也会降低得胚率。本试验田间自然生长条件下未剥出单倍体胚，可能就是由于田间生长时长期套袋且不通风使得麦穗湿度过大，麦穗大部分滋生霉菌，子房未正常发育所致。

培养液中的成分也是影响杂交穗离体培养效果的一个重要因素。本试验中离体培养A、B、C和D四个批次的平均得果率为仅为42.91%，比田间自然生长条件下的平均得果率低23.36%，后期经检查发现这四个批次培养液所用的亚硫酸过期失效，换掉失效的亚硫酸后，离体培养H、I等批次的得果率和得胚率明显上升。所以亚硫酸的失效可能是导致得果率较低且幼胚发育不完全、幼胚较小、大部分未正常发育为幼苗的原因，但还需要进一步验证。

利用小麦与玉米进行远缘杂交诱导产生单倍体植株，在自然条件下其染色体不能加倍，必须经过人工染色体加倍后才能获得育种上可利用的纯合双单倍体小麦，从而稳定地遗传下去。通常利用秋水仙素对小麦的根部进行处理的方法来诱导染色体加倍，但秋水仙素使用浓度过高时会产生毒害，导致烂根现象，进而会降低植株的成活率。陈新民等用浓度分别为500mg/L、750mg/L和1000mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)处理已有2～3个分蘖的单倍体小麦植株5h，并且给予光照、温度控制在23℃～25℃，后期测得三个浓度下的加倍率分别为89.6%、76.05%和73.3%，该研究还认为培育壮苗是提高染色体加倍效率的重要因素[17]。本课题组前期研究表明，用750mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)处理单倍体小麦苗5h的加倍效果最好(86.4%)，并且处理时持续供应O2能够提高加倍率及加倍处理效率[18]。本试验就是用750mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)并持续通O27h处理离体培养获得的200多棵单倍体小麦植株，最终获得156棵染色体成功加倍的小麦双单倍体植株。