碱异构化亚麻酸合成共轭亚麻酸

付若凝 徐坤华 樊 晔 方 云* 方银军

1.江南大学合成与生物胶体教育部重点实验室，化学与材料工程学院，江苏无锡，214122；2.赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州，310030

共轭亚麻酸（CLN）是一类十八碳共轭三烯酸的总称，由多种位置和几何异构体组成[1,2]。CLN比共轭亚油酸（CLA）具有更强的生理活性，其抗癌、抗氧化、降血糖及降胆固醇等功能被用于医药及营养添加剂[1-5]。CLN以甘油酯的形式天然存在，富含于桐籽[6]、苦瓜籽[7]、石榴籽[8]等植物种子中，但其不易水解且后期分离提纯困难，故从植物种子中富集CLN的收率低[2]。目前主要采用化学法[9]和生物法[10,11]合成CLN，生物法选择性高但特异酶不易获得且过程烦琐和副产物较多，而化学法收率虽较低[12,13]但步骤简单且易于量产。化学法主要包括碱异构化法、化学合成法和脱水法。碱异构化天然α-亚麻酸（LN）是目前合成CLN的高效方法，常用的催化剂为叔丁醇钾和KOH等[12,13]，常用的溶剂为乙二醇（EG）、丙三醇等[5]。2000年Igarashi等[13]在KOH-EG体系中异构化合成CLN的收率为22.5%，后期经改进有所提高[9]。本文将以LN为原料，考察碱异构化法中催化剂种类和用量、溶剂种类和用量、异构化时间和温度的影响，并探讨其分离纯化。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

尿素、氢氧化钾、叔丁醇钾、氯化钠、无水乙醇、95%乙醇、乙二醇、丙三醇、无水乙醚，均为AR，购自国药集团化学试剂有限公司；LN（73%）根据文献方法[14]从亚麻籽油（市售食品级）中提取；超纯水（18.2MΩ·cm），南京艾普瑞UPW-30UV超纯水机制备。

TU-1950型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；GC9720型气相色谱仪，温岭市福立分析仪器有限公司；Nicolet 6700型红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；DF-101S型集热式磁力搅拌器，金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2 碱异构化合成CLN

将LN、碱和溶剂按一定比例加入三口烧瓶中，在N2保护下加热至指定温度后，回流反应一定时间。产物冷却至室温，用2 mol/L盐酸酸化至pH为2～3，经无水乙醚萃取及饱和食盐水洗涤至中性后，用无水Na2SO4干燥、过滤后得到棕褐色油状固体，即为CLN粗产物。

1.3 尿素包合法富集CLN

在80℃、N2保护、搅拌回流的条件下，将尿素全部溶解在95%乙醇中，然后滴加CLN粗产物的95%乙醇溶液，滴加完毕后继续回流1 h。冷却至室温后置于-18℃包合结晶10 h，快速抽滤并将滤液旋转蒸发去除溶剂乙醇。产物用2 mol/L盐酸酸化至pH为2～3，经无水乙醚萃取及饱和食盐水洗涤至中性后，用无水Na2SO4干燥、过滤后旋蒸得到CLN棕褐色油状固体。

1.4 低温分步结晶法富集CLN

根据脂肪酸熔点差异[16]，称取5 g的CLN粗产物，加入一定体积的溶剂（甲醇、乙醇、丙酮）在指定温度下结晶一定时间，迅速抽滤，收集晶体并再加入上述溶剂，于33℃进行二次结晶，1 h后迅速抽滤得到CLN白色晶体。

1.5 CLN的分析方法

称取50 mg白色晶体CLA于试管中，加入1 ml三氟化硼-甲醇溶液，于沸水浴中加热3 min，冷却至室温后用1 ml无水乙醚萃取，充分摇匀后加入3 ml饱和食盐水，静置至溶液分层，取乙醚层经无水Na2SO4干燥后用气相色谱分析各组分含量，以面积归一化法计算产物中各组分峰面积百分比[17]。气相色谱条件：PEG-20000毛细管柱（60m×0.32mm），FID检测器，柱温240℃，进样器温度280℃，检测器温度280℃；载气（N2）柱前压0.14 MPa，载气（N2）流速0.1 ml/min，进样量0.4 μL[18]。采用涂膜法测定其红外光谱。用无水乙醇配制0.01 g/L的CLN溶液，利用紫外分光光度计测定其紫外光谱。

2 结果与讨论

2.1 CLN结构鉴定与含量分析

图1为CLN白色晶体及CLN粗产品的紫外光谱图，268 nm处为共轭三烯的特征吸收峰，归因于CLN的π-π＊跃迁；234 nm处为共轭二烯的特征吸收峰，归因于未完全共轭LN的π-π＊跃迁[18]。图2为CLN和LN的红外光谱图，3018 cm-1和1654 cm-1处分别对应不饱和碳氢（=CH）和碳碳双键（C=C）的伸缩振动峰，1710 cm-1处为羰基（C=O）的特征吸收峰，992 cm-1附近为共轭三烯的特征吸收峰，而967 cm-1处对应共轭二烯的特征吸收峰[9]。CLN白色晶体和LN经甲酯衍生化后的气相色谱见图3，根据色谱柱极性以及各组分极性进行综合判断[19]，左图中保留时间在28～35 min的峰群为CLN组分，面积归一化法计算面积百分比为90.0%；右图中保留时间在26～28 min的峰群为LN组分[14]，面积百分比为73.0%。

图1 CLN白色晶体（a）和CLN粗产品（b）的紫外光谱图

图2 CLN和LN的红外光谱图

图3 CLN（a）和LN（b）甲酯衍生化产物的气相色谱图

2.2 合成条件的影响

以EG为溶剂及KOH为催化剂，考察投料比、异构化时间和温度对CLN含量的影响，以紫外吸光光度法计算的CLN含量结果见表1。CLN含量随反应时间延长和温度升高均先增加后减小，这是因为延长时间和升高温度虽然可以使异构化更加充分，但也会使LN、CLN等分子发生聚合[9]；CLN含量随m（LN）∶m（KOH）及m（LN）∶V（EG）减小而增大，但过度添加碱及增大溶剂比例均会增大消耗。LN在KOH-EG体系中适宜异构化条件为m（LN）∶m（KOH）∶V（EG）=1∶1.6∶10、反应温度160℃、反应时间100 min，此时产物中CLN含量为40.0%，CLN收率为52.3%。在上述优化条件下，分别以丙三醇和叔丁醇钾替换EG和KOH，异构化结果见表2，发现两者的CLN含量均不如KOH-EG体系。

表1 KOH-EG体系中异构化条件对CLN含量的影响

表2 溶剂和催化剂种类对碱异构化结果的影响

2.3 尿素包合法富集CLN

改变CLN粗产物、尿素和95%乙醇的比例探索包合的适宜条件。由表3可知，m（CLN粗产物）∶m（尿素）∶V（95%乙醇）=1∶2.5∶8时，富集效果最好，CLN含量由粗产物中的40.0%提高到74.3%。

表3 不同尿素包合条件富集物中CLN含量

2.4 低温分步结晶法纯化CLN

根据表4中各物质的熔点差异分别考察了m（CLN粗产物）∶V（乙醇）＝1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9，时间为4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h，温度为-18℃、-5℃时所得纯化晶体中CLN的含量，发现m（CLN粗产物）∶V（乙醇）=1∶3时，在-18℃结晶6 h效果最好，CLN含量由40.0%提高到77.4%。继续以m（CLN粗产物）∶V（乙醇）=1∶3在33℃下结晶1 h，CLN含量可以提高到88.3%。重复上述操作，CLN含量可以提高到90%以上。在上述优化条件下，分别以甲醇和丙酮替换乙醇，两者富集的CLN含量均低于乙醇体系。

表4 CLN粗产品中主要成分的熔点

图4为粗产品、尿素包合富集物和低温分步结晶富集物中CLN含量，可见两种方法均可有效提高产品中CLN的含量，结晶法更有利于深度纯化CLN。

图4 粗产品、尿素包合富集物和低温分步结晶富集物中CLN含量

3 结论

本文以LN为原料，通过碱异构化法合成了CLN，考察催化剂种类和用量、溶剂种类和用量、异构化时间和温度对碱异构化过程的影响，发现以EG为溶剂，KOH为催化剂，m（LN）∶m（KOH）∶V（EG）=1∶1.6∶10时在160℃下反应100 min异构化结果最好，CLN的含量可达40.0%。当m（CLN粗产物）∶m（尿素）∶V（95%乙醇）=1∶2.5∶8时，尿素包合富集结果最明显，CLN含量为74.3%。采用低温分步结晶法在-18℃和33℃分步富集，CLN含量可以提高到90%以上。碱异构LN合成CLN及其提纯过程操作简单，产物富集率高，易于量产。