东海乌参皂苷提取工艺优化与抗氧化研究

叶大天，陈 伟，林 琳，张雷芳，郑 斌，闻正顺

(浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022)

东海乌参Acaudina leucoprocta 是芋参目Molpadida、尻参科Caudinidae、海地瓜属Acaudina 动物[1]。相关的研究发现海地瓜不仅富含多种维生素、蛋白质、微量元素，并且也含有海地瓜皂苷和多糖[2]。近年来，有学者对东海乌参蛋白肽进行了研究，借助蛋白酶解和自溶的技术，从而获得了高得率的蛋白肽[3]；也有学者对东海乌参多糖进行了结构解析并对其抗凝血活性研究[4]，但对东海乌参皂苷的研究鲜有报道。天然存在的皂苷是类固醇、生物碱和三萜的糖苷，它广泛分布在自然界中[5]。研究表明皂苷具有抗肿瘤、降血脂、改善非酒精性脂肪肝、抑制脂肪蓄积、抗炎等多种生物学特性[6-7]。此外皂苷还具有治疗临床抑郁症的潜力[8]。海参皂苷存在于其体壁和居维氏小管中[9]，其在改善高脂饮食引起的肥胖、抗癌等方面发挥作用[10-11]。实验利用乙醇-水作为溶剂，对东海乌参皂苷进行提取并优化工艺条件，并对东海乌参总皂苷的抗氧化能力进行研究，以期为东海乌参皂苷的开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

东海乌参:东海乌参冻品，解冻后剪碎，置烘箱低温烘干后，粉碎成粉末待用；人参皂苷Re 标准品（源叶生物）；无水乙醇、香草醛、正丁醇、盐酸、Tris-HCl（分析纯AR，国药集团）；冰醋酸、浓硫酸、DPPH（分析纯AR，阿拉丁）；邻苯三酚（分析纯AR，安耐吉）；硫酸亚铁、水杨酸（分析纯AR，麦克林）；H2O2（分析纯AR，南京化学试剂）；维生素C（分析纯AR，Sigma）。

1510 酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；N-1100 旋蒸仪（上海爱朗仪器有限公司）；B-260 水浴锅（上海亚荣仪器有限公司）；JM-B1003 天平（上海数谊电子衡器有限公司）；BSA124S 分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 皂苷提取

称取东海乌参粉末10 g，根据设定的乙醇浓度，加入一定料液比的乙醇水溶液，置入恒温水浴锅中，加热提取一定时间后，过滤取上清，残渣重复之前的操作，提取3 次，合并上清液。上清旋蒸浓缩成膏状，加入一定体积的蒸馏水充分溶解，得到待测溶液。

1.2.2 皂苷含量测定

精准配制0.2 mg·mL-1的人参皂苷Re 标准溶液，将0、40、80、120、160、200 μg（分别相当于吸取人参皂苷0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL）的标准溶液加入到玻璃试管中，置于水浴锅中加热蒸干，然后加入0.2 mL 的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL 的高氯酸，置于水浴锅中60 ℃水浴15 min，接着冰浴5 min，然后加入5 mL 的冰醋酸，将溶液摇晃均匀后，静置10 min，在548 nm 下测定其吸光度[12]。而后，以加入的人参皂苷的样品量为横坐标，样品的吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1）。

图1 人参皂苷Re 标准曲线Fig.1 The standard curve of ginsenoside Re

吸取200 μL 待测样品溶液于小试管内，水浴蒸干，参照上述方法处理后在548 nm 下测定其吸光度，根据公式计算得到皂苷的得率。

式中:X 为测定的试样中总皂苷的得率，%；m 为样品加入的质量，g；m1为通过吸光度从标准曲线中查得测定样品的皂苷含量，g；V1为样品提取液总体积，mL；V 为样品提取液中用于测定的体积，mL。

1.2.3 单因素实验设计

固定料液比为1：10 g·mL-1，提取时间为3 h，提取温度为70 ℃，探究不同乙醇浓度（30%、45%、60%、75%、90%）对皂苷得率的影响；固定乙醇浓度为60%，提取时间为3 h，提取温度为70 ℃，探究不同的料液比（1：4、1：7、1：10、1：13、1：16 g·mL-1）对皂苷得率的影响；固定乙醇浓度为60%，料液比为1：10 g·mL-1，提取温度为70 ℃，探究不同提取时间（1、2、3、4、5 h）对皂苷的得率的影响；固定乙醇浓度为60%，料液比为1：10，提取时间为3 h，探究不同的提取温度（40、50、60、70、80 ℃）对皂苷得率的影响。

1.2.4 正交试验设计

由单因素的实验结果来确定各因素适宜的提取条件，通过实验的因素的个数和水平数来选取正确的正交试验表，实验选取正交表L9(34)进行实验（表1），确定最佳的工艺条件。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels in orthogonal test

1.2.5 东海乌参总皂苷抗氧化活性研究

1.2.5.1 待测样品处理

用优化的工艺条件提取粗提液，旋蒸浓缩后，以1:1 比例用正丁醇萃取3 次，所得萃取液经旋蒸后溶于水中，过HP20 大孔树脂，首先用水和20%乙醇溶液洗脱多糖蛋白等杂质，再用80%乙醇洗脱，最后用100%乙醇洗脱小极性的物质，收集80%乙醇洗脱液，旋蒸浓缩冻干后得到东海乌参总皂苷以供测定。

1.2.5.2 东海乌参总皂苷清除超氧阴离子自由基能力的测定

配置浓度为2.0、4.0、6.0、8.0 以及10.0 mg·L-1总皂苷和维生素C 溶液。将2.25 mL 的Tris-HCl 溶液（0.1 mol·L-1，pH 8.2）加入试管内，在25 ℃水浴20 min，加入500 μL 待测液与250 μL 邻苯三酚溶液（25 mmol·L-1），在室温下反应5 min，然后加入0.5 mL 的HCl 溶液（8%）。静置一段时间后取样，在325 nm波长下测定其吸光度。其中样品本底组需将等体积的去离子水替换为邻苯三酚溶液（25 mmol·L-1），空白组则需要以等体积的去离子水替换样品溶液。

式中:C 为清除率，%；P0为空白组吸光度，nm；PX为样品组吸光度，nm；PX0为本底组吸光度，nm。

1.2.5.3 东海乌参总皂苷清除羟基自由基能力的测定

配置浓度为2.0、4.0、6.0、8.0 以及10.0 mg·mL-1总皂苷和维生素C 溶液。将500 μL 的样品加入试管中，依次加入0.5 mL FeSO4溶液（6 mmol·mL-1）与1 mL 水杨酸乙醇溶液（6 mmol·mL-1）以及1 mL H2O2溶液（6 mmol·mL-1）混匀。将样品置于37 ℃水浴反应25 min，在510 nm 波长下测定其吸光度。其中样品本底组需将等体积的去离子水替换为H2O2溶液（6 mmol·mL-1），空白组则需要以等体积的去离子水替换为样品溶液。

1.2.5.4 东海乌参总皂苷清除DPPH 自由基能力的测定

配置浓度为2.0、4.0、6.0、8.0 以及10.0 mg·mL-1总皂苷和维生素C 溶液。以无水乙醇配制浓度为25 μg·mL-1DPPH 溶液，加入0.5 mL 于试管中，然后加入待测液0.5 mL 混匀，并于暗处反应30 min，反应结束后在517 nm 波长下测定其吸光度。其中样品本底组需将等体积的无水乙醇替换为DPPH 溶液（25 μg·mL-1），空白组则需要以等体积的去离子水替换为样品溶液。

1.3 数据分析

利用Excel 2007 进行实验数据的整理，利用GraphPad Prism8.0.1 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对皂苷得率的影响

由图2 可知，随着乙醇浓度的增大，皂苷的得率先平缓上升而后急剧下降，而在60%乙醇浓度时得率达到最大值，为0.238%。在30%～60%乙醇浓度时，皂苷的得率平缓上升，可能是由于在低乙醇浓度下东海乌参中的皂苷成分无法有效溶解于提取液中，而在75%～90%浓度下，皂苷得率开始下降，至90%出现骤跌，可能是东海乌参中水溶性皂苷无法有效溶解，从而导致提取总皂苷含量下降。

图2 乙醇浓度对皂苷得率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the yield of saponin

2.2.2 提取温度对皂苷得率的影响

由图3 可知，随着提取温度的升高，皂苷的得率总体呈现先升高后下降的趋势，而在提取温度为70 ℃时皂苷得率最高，达0.238%。当提取温度较低时，东海乌参中的皂苷无法有效溶解在浸提液内，但随着提取温度逐渐升高后，其内容物则开始明显溶出。而当提取温度过高后，皂苷得率又开始下降，这可能是因为温度过高导致东海乌参中皂苷成分被破坏，使得皂苷的得率下降。

图3 提取温度对皂苷得率的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on the yield of saponin

2.2.3 提取时间对皂苷得率的影响

由图4 可知，皂苷的得率随着提取时间的延长呈现先上升后下降的趋势，而在提取时间为3 h 时得率达到最大值。因此，在提取时间为3 h 时，皂苷的溶解即达到了平衡，继续延长加热时间则会造成皂苷成分的破坏，从而减少了所提取皂苷的总量，造成得率下降。同时延长提取时间可能会造成大量的杂质溶出，这会影响皂苷的纯度，不利于后续纯化。

图4 提取时间对皂苷得率的影响Fig.4 The effect of extraction time on the yield of saponin

2.2.4 料液比对皂苷得率的影响

由图5 可知，当料液比低于1：10 时，随着料液比的不断增大，皂苷得率呈现上升的趋势，而后趋于平稳。可能原因是当料液比较小时，加入的提取液体积不足，在浓度饱和的情况下无法将样品内所含皂苷完全溶解，从而降低了提取效率。而当提取溶剂足够后，由于样品所含皂苷量有限，继续增大料液比无法提高得率。

图5 料液比对皂苷得率的影响Fig.5 The effect of liquid to material ratio on the yield of saponin

2.2 正交试验结果

由表2 正交试验结果可知，提取条件对东海乌参皂苷的得率影响由大到小依次为:料液比＞乙醇浓度＞提取时间＞提取温度，依据图中预测的最佳提取工艺条件为A2B1C2D3，即在乙醇浓度60%，提取温度60 ℃，提取时间3 h，料液比为1:13 的条件下提取东海乌参皂苷，在此条件下皂苷的得率为0.317%。

表2 正交试验结果Tab.2 Orthogonal experimental results

2.3 东海乌参总皂苷抗氧化能力测定结果

2.3.1 东海乌参总皂苷清除O2-·能力

根据图6 结果可知，东海乌参总皂苷具有良好的O2-·清除能力，其清除能力随着总皂苷的浓度增大总体趋于平稳，清除率变化幅度在91.98%～97.20%之间，与维生素C对O2-·清除能力接近。但是在同等的质量浓度下，东海乌参总皂苷清除O2-·的能力略低于维生素C。

图6 东海乌参皂苷清除O2-·能力Fig.6 O2-·scavenging activity of saponin from A.leucoprocta

2.3.2 东海乌参总皂苷清除·OH 能力

根据图7 结果可知，东海乌参总皂苷对·OH 的清除能力随着质量浓度的增大呈现上升的趋势。当质量浓度为10 mg·mL-1时，东海乌参总皂苷对·OH 的清除率达22.14%。而在2～10 mg·mL-1质量浓度范围内，维生素C 对·OH 的清除能力变化不大，维持在100%上下轻微波动，明显优于东海乌参总皂苷。

图7 东海乌参皂苷清除·OH 能力Fig.7 ·OH scavenging activity of saponin from A.leucoprocta

2.3.3 东海乌参总皂苷清除DPPH·能力

根据图8 结果可知，东海乌参总皂苷对DPPH·的清除能力呈现先上升后趋于平稳的趋势。当东海乌参总皂苷浓度为6 mg·mL-1时，其对DPPH·的清除能力为99.66%。维生素C 对DPPH·清除能力相对平稳，浓度范围内的清除率波动为95.46%～97.19%，其清除率总体较高。总体来说，在2.0～6.0 mg·mL-1浓度范围内，维生素C 的DPPH 清除能力要高于东海乌参总皂苷，但在浓度为6.0～10.0 mg·mL-1时，两者的清除能力大体一致。

图8 东海乌参皂苷清除DPPH·能力Fig.8 DPPH·scavenging activity of saponin from A.leucoprocta

3 讨论和总结

皂苷分为三萜和甾体糖苷两大类，它们的结构特征因连接在不同位置的糖单元数量而异[13]。根据它的结构的特点，可用水或者甲醇作为溶剂进行提取[14]，而大多数海参皂苷常用乙醇-水提取[15]。有学者用响应面的方法优化海地瓜皂苷的提取工艺，得到最佳工艺条件为乙醇浓度为79%，提取温度为73.5 ℃，提取时间为2.75 h，料液比为1：1.7 g·mL-1，得率达0.378%[16]。对于提取出来的皂苷含量的检测，分光光度法是常用的方法。总皂苷也称为香草醛-硫酸测定，该方法的基本原理是氧化三萜皂苷与香草醛的反应[17]。

另外，科学上发现皂苷具有抗氧化、抗癌等药物特性[17-19]。因此皂苷是值得综合开发与利用的集医疗、食品及饲料安全添加于一体的生物活性物质[20]。研究采用单因素实验研究了乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比4 个因素对东海乌参皂苷得率的影响，并通过正交试验确定了东海乌参皂苷提取的最佳工艺条件，而在最佳工艺条件下，东海乌参皂苷得率达0.317%。同时，研究了东海乌参总皂苷的抗氧化能力，其具有良好的O2-·和DPPH·清除能力。而实验不足之处是只利用显色法对东海乌参皂苷进行了初步的判断，对于皂苷的结构还无法做出解析，因此后续可以进一步进行分离纯化得到单体，对结构进行解析以及进一步的活性研究。