CHI3L1基因突变与颈动脉粥样硬化斑块稳定性的关系

张明明 李明泉 赵雪平 刘 欣 崔 佳

颈动脉粥样硬化斑块(carotid atherosclerosis plaque, CASP)可破裂或脱落造成急性脑血管意外[1,2]。动脉硬化斑块的破裂或脱落与斑块内新生血管形成有关，新生血管形成过程中遗传因素发挥了重要作用[3～6]。几丁质酶3样蛋白1(chitinase 3-like 1, CHI3L1/YKL-40)基因在体内分布广泛，可促进其他炎性因子的分泌。有研究报道，CHI3L1与糖尿病患者微血管病变有关[7]；也有研究报道，CHI3L1能促进血管生成，可促进肿瘤细胞扩散和转移[8,9]。但CHI3L1基因突变与颈动脉斑块形成的关系报道较少。本研究检测了颈动脉粥样硬化患者CHI3L1基因rs880633位点突变情况，并对突变情况与新生血管的关系进行了分析，为探讨斑块内新生血管的形成机制提供依据。

对象与方法

1.研究对象：选取2015年1月～2019年12月在笔者医院功能科行颈动脉超微血管成像(super microvascular imaging, SMI)技术检查颈动脉粥样硬化斑块者502例为研究组，男性279例，女性223例，患者年龄30～64岁，平均年龄47.23±11.42岁；取同期性别年龄匹配的超声未发现斑块者480例为对照组，年龄26～66岁，男性268例，女性212例，平均年龄47.87±12.56岁。所有入组者血糖在正常范围，排除肝脏、肾脏疾病、冠心病、恶性肿瘤及脑梗死等病史。入组者均为长期居住(10年以上)在河北的汉族人群。本研究得到河北省人民医院医学伦理学委员会的批准(伦理审批号：2020科研伦审第14号)，患者均签署知情同意文件。

2.颈动脉SMI检查及判断标准：采用日本东芝(Aplio500型)彩色多普勒超声仪，11-L4 探头，频率4～11MHz，检测颈动脉内膜中层厚度(IMT)，测量3次取平均值。IMT≥1.5mm定义为斑块。应用超微血管成像(SMI)技术检测低速血流图像，对新生血管分级。分级标准： 0级，斑块较均匀，无增强；1级，斑块内显示1～3处点状增强；2级，斑块内显示多于3个点状增强和(或)1～2处短线样增强；3级，斑块内显示多于2处线状增强，并贯穿或大部贯穿斑块，或有血液流动征[10]。

3.生化指标检测：取入组者空腹静脉血5ml，放入促凝管，使用美国Beckman全自动生化分析仪(U5821型)检测所有入组者血清总胆固醇(cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、采用美国雅培全自动化学发光仪(i2000型)检测血清脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein phospholipase A2，Lp-PLA2)、美国R&D Systems生物有限公司的试剂盒检测血清YKL-40蛋白水平。

4.CHI3L1基因多态性检测：采取空腹静脉血4ml，-80℃保存。取EDTA-2Na抗凝血400μl，按照试剂盒说明书提取血液基因组DNA。-80℃保存。建立20μl PCR体系：各样本基因组DNA模板1μl，kod plus酶0.5μl(5U/μl)，上下游引物各1μl，缓冲液buffer 2μl，dNTP 混合液1μl。按说明书操作。上游引物：5＇-CGCACCCATGGCTTTGATGG-3＇，下游引物：5＇-CTGACCTGACCAGCACCTTG-3＇。纯化各PCR扩增产物， Beckman Coulter GeXP型遗传分析系统进行双向测序检测。使用DNAMAN v6.0.3.99软件将GeneBank中的CHI3L1基因第5外显子序列与研究的测序结果进行比对。

结 果

1.一般临床特点比较：研究组血清Lp-PLA2、YKL-40、TC、LDL-C，BMI、家族史比例均明显高于对照组，而HDL-C低于对照组(P<0.05),详见表1。

表1 研究组和对照组一般情况及血脂水平的比较

2.颈动脉SMI分级结果：按超声检测结果将颈动脉斑块分为4级，其中0级增强146例，占29.08%；男性70例(47.95%)、女性76例(52.05%)。1级增强147例，占29.28%；男性73例(49.66%)、女性74例(50.34%)。2级增强129例占25.70%；男性106例(82.1%)、女性23例(17.83%)。3级增强80例，占16.33%；男性61例(76.25%)、女性19例(23.75%)。

3.CHI3L1基因rs880633位点基因多态性组间比较：研究组基因遗传平衡检查结果显示，研究组数据未达到遗传平衡要求(χ2=30.685，P<0.01)；对照组基因遗传平衡检查结果，对照组数据达到了遗传平衡要求(χ2=5.008,P=0.082)。CHI3L1基因rs880633位点在研究组中AA、AG、GG基因型的分布频率分别为71.51%、18.73%和9.76%，在对照组中分别为96.25%、2.71%和1.04%，差异有统计学意义(χ2=109.65，P<0.01)。等位基因G在研究组的频率明显高于对照组(χ2=140.86，P<0.01)。研究组的GG及AG基因型明显高于对照组(χ2=73.76，P<0.01；χ2=45.01，P<0.01，表2)。

表2 CHI3L1基因rs880633位点基因多态性在研究组和对照组的分布情况[n(%)]

4.CHI3L1基因rs880633位点基因多态性在不同SMI分组间比较：研究组按SMI标准分组后,发现3级增强组GG、AG基因型及G等位基因明显高于其他组(P<0.05)；2级增强组上述指标比例明显高于0级和1级增强组(P<0.05，表3)。

表3 CHI3L1基因rs880633位点基因多态性在各组分布情况[n(%)]

5.CHI3L1基因rs880633位点多态性的测序结果：结果发现该位点存在等位基因A和G，基因型包括AA、AG、GG 3种基因型，详见图1。

图1 CHI3L1基因rs880633突变位点多态性分析的测序结果AA基因型双向测序均无突变碱基，AG基因型其中一条链中的碱基由A突变为G、GG基因型(GG)两条链中的碱基均由A突变为G

6.CHI3L1基因rs880633突变位点不同基因型间血脂和炎性因子比较：按照基因型进行分组，研究组和对照组血清TC、LDL-C、Lp-PLA2、YKL-40的水平随着AA、AG、GG基因型逐渐升高，HDL-C的水平逐渐下降(P<0.001)；TG水平与基因型无关(P=0.111，表4)。

表4 CHI3L1基因rs880633突变位点不同基因型间血脂和炎性因子比较

7.CHI3L1基因rs880633突变位点与CASP新生血管的关系：以斑块是否出现新生血管作为应变量(有=1，无=0)，以TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp-PLA2、YKL-40、CHI3L1基因 rs880633位点[AA(0，1)，AG(1，0)，GG(1，1)]为自变量进行分析，Logistic回归分析结果显示，CHI3L1基因 rs880633位点AG、GG基因型，血清Lp-PLA2、YKL-40水平升高、血清HDL-C水平降低与新生血管有关，G等位基因、血清Lp-PLA2、YKL-40水平是新生血管发生的独立危险因素(P<0.05)，血清HDL水平是保护性因素(P<0.05，表5)。

表5 多因素Logistic回归分析结果

讨 论

颈动脉粥样硬化是常见疾病，与脂代谢异常及遗传有关[11, 12]。本研究发现研究组的家族史阳性的比例更高，证明遗传因素与斑块有关；还发现研究组血清Lp-PLA2、YKL-40的水平与对照组比较有明显的升高，提示炎性反应与斑块形成有关。本研究入组者为河北常住人口，能反映出当地患者动脉硬化斑块新生血管情况。

颈动脉粥样硬化斑块内新生血管与脑血管急性意外事件关系密切[13～16]。斑块内新生血管生成可诱发出血，从而导致斑块不稳定甚至脱落，发生脑梗死[17～20]。本研究采用SMI检查对新生血管的情况分析发现，2级和3级增强的斑块比例占研究组的40%左右，这种斑块新生血管不稳定性高，容易脱落阻塞血管，及时发现并采取治疗措施具有重要意义。

研究表明CHI3L1基因与多种疾病有关，但迄今还未见CHI1L3基因与CAS斑块新生血管之间关系的报道[7～9]。CHI1L3基因的rs880633位点多态性是第5外显子上的错义突变，即第145位氨基酸的第一个密码子由A突变为G，导致第145位精氨酸(Arg)被甘氨酸(Gly)替代，突变位点位于活性区域，突变之后影响了蛋白的生物活性。本研究的遗传平衡检验结果显示对照组基因型分布符合遗传平衡规律，而研究组遗传平衡检验不符合遗传平衡结果。由于突变可影响遗传平衡结果，因此笔者研究认为CHI1L3基因基因突变可能是导致颈动脉斑块新生血管生成的重要因素。

本研究结果显示研究组AG、GG基因型比例及G等位基因的频率均明显高于对照组。研究组斑块按SMI结果分级后发现随着SMI级别增强AG/GG基因型比例及G等位基因的频率逐渐升高，提示CHI1L3基因rs880633位点突变可能在新生血管生成过程中发挥了重要作用。本研究结果还显示血清TC、LDLC、Lp-PLA2、YKL-40、HDL-C水平与基因型关系密切，说明基因型可能通过调控血脂及炎性因子水平影响斑块内新生血管的生成。多因素Logistic回归分析结果显示，CHI1L3基因rs880633位点G/G基因型对CAS新生血管严重程度的危险性OR(95% CI)值为8.109(3.297～16.845)，A/G基因型对CAS新生血管严重程度的危险性OR(95% CI)值为3.658(2.557～6.760)，进一步验证了CHI1L3基因rs880633位点G/G基因型，尤其是G等位基因与颈动脉斑块新生血管有关。

本研究发现，CHI1L3基因rs880633位点多态性与颈动脉粥样硬化斑块新生血管的发生及严重程度有关，这可能是影响斑块稳定性的重要因素，但具体的临床意义还有待于深入研究。