bta-miR-377琼脂糖凝胶电泳条件优化

郝琴琴，任 静，成俊丽，李鹏飞

（山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801）

miRNA是一类长度为20～24 nt的小分子RNA，主要通过碱基互补配对方式识别靶基因mRNA，并根据其互补程度的不同指导沉默复合体降解靶基因mRNA或抑制其翻译，进而调控动植物生理过程[1]。LEE等[2]首次在线虫体内发现lin-4能靶向结合目的mRNA的3'UTR区，调控线虫发育，确认其为miRNA，随后在不同物种中检测出多种miRNA，并对其功能进行研究。近年来，大量研究表明，miRNA对卵泡发育和卵母细胞的成熟起着重要作用，ZHANG等[3]利用高通量测序技术对超排处理的羔羊和成年绵羊卵巢中差异表达miRNA的研究发现，miR-377-3p在超排处理的羔羊卵巢中大量表达，推测其可能影响卵母细胞生长；WANG等[4]研究发现，miR-377可能通过与MMP-16相互作用影响卵细胞的生长。而miR-377对牛卵泡发育的影响尚未见报道。

CART作为下丘脑分泌的一种神经肽，是抑制卵泡优势化的重要因子[5]。通过生物信息学方法已明确bta-miR-377与CART存在靶向作用。而关于miRNA的表达鉴定方法多样，其中最早利用Northern blot技术对miRNA的表达水平进行鉴定[6-7]，其原理是用探针对电泳分离的RNA样品进行杂交检测，主要克服miRNA表达量低且稳定性差的问题，但该技术存在灵敏度低、所用样品量大、耗时多且无法利用高通量对所得结果进行检测等缺点[8]；微阵列是另一种分析miRNA表达的传统方法[9]，可进行高通量分析，但存在耗时和灵敏度低的缺陷，使其应用范围受限；半定量RT-PCR技术检测miRNA内源性表达具有高效、便捷等优点，但由于miRNA条带过短不易表达或受到电泳条件如电源电压、电泳时间、核酸染料、凝胶浓度等多种因素的影响，试验中易出现无目的条带、非特异性条带多等情况，因此需要对试验条件进行优化[10]。

本研究采用茎环结构法对bta-miR-377引物序列进行特异性延长，利用半定量RT-PCR技术检测牛下丘脑中bta-miR-377的表达，通过比较不同凝胶浓度、电源电压、时间下bta-miR-377条带的分布情况，对电泳条件不断进行优化，旨在分离鉴定bta-miR-377，为bta-miR-377在牛下丘脑组织中有内源性表达提供依据，并为进一步研究其通过CART调控牛卵泡发育进程奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料选取文水县肉牛屠宰场3头年龄相近且健康的西门塔尔母牛，采集其下丘脑组织后置于液氮中保存。

主要试剂包括PCR扩增试剂盒（北京康为世纪公司）；Trizol（Invitrogen公司）；miRNA cDNA茎环法第1链合成试剂盒（上海生工公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 从miRbase数据库中获得目的bta-miR-377成熟序列，利用茎环结构法设计bta-miR-377反转录引物与PCR扩增引物，得到3条引物序列，由上海生工公司合成，具体序列如表1所示。

表1 研究所用引物序列Tab.1 Sequences of primer s used in this study

1.2.2 总RNA提取与bta-miR-377反转录 利用Trizol法提取牛下丘脑组织中总RNA，核酸浓度检测合格后进行反转录，按照反转录试剂盒说明书要求进行操作。反应体系为：RNA 4μg，2×miRNA LRT Solution mix 10μL，Stem-loop primer（10μmol/L）1μL，miRNA L-RT Enzyme mix 1.5μL，RNasefree water 3.5μL，总体积为20μL。所得cDNA于4℃保存。

1.2.3 PCR扩增 对获得的cDNA进行PCR扩增，扩增体系为：2×EsTaqMaster Mix 10μL，上下游引物各1.5μL，模板cDNA 3μL，ddH2O 4μL，总体积为20μL。PCR扩增条件为：94℃5 min；94℃30 s，退火温度58～63℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃5 min。4℃保存。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳及灰度分析 分别设置不同琼脂糖凝胶电泳条件（琼脂糖凝胶浓度2.0%、2.5%；电泳电压100、80 V；电泳时间80、60 min）分离鉴定PCR扩增产物，并利用Image J软件在一定面积和像素数下，对不同电泳条件bta-miR-377的70 bp左右条带除背景像素外的所有有效像素灰度平均值进行灰度分析。

1.3 数据分析

试验重复3次，运用GraphPad Prism 8.0.2进行数据分析；组间数据分析采用t检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同电泳条件对bta-miR-377条带迁移的影响

RNA提取后，经检测RNA浓度与纯度均符合试验要求。经2.0%、2.5%琼脂糖凝胶于100 V电泳40 min后结果如图1所示，已知bta-miR-377大小为70 bp，当凝胶浓度为2.0%时，Marker条带堆积、拖尾，且无法区分目的条带；当凝胶浓度为2.5%时，Marker条带迁移效果较好，但略有拖尾，目的条带出现70 bp左右，可见后者的分辨率高于前者，表明凝胶浓度为2.5%时适合bta-miR-377表达检测。

进一步对电泳电压和时间进行优化，当100 V延长电泳时间至60 min时，Marker条带拖尾且目的条带弥散，说明长时间高压可能会导致缓冲液温度过高而使DNA降解；80 V 60 min相较于100 V 60 min的Marker条带完全分离，但目的条带过宽，可能是由于电泳时间太短DNA分子没有聚集；而80 V 80 min相较于80 V 60 min的Marker完全分离，且目的条带集中清晰，没有非特异性扩增。

综上可见，2.5%琼脂糖凝胶、80 V 80 min为本研究范围内分离bta-miR-377的最优电泳条件。

2.2 灰度分析

采用Image J软件分析凝胶浓度为2.5%时，不同电压和电泳时间下bta-miR-377条带表达情况影响，其结果如图2所示，时间分别为60 min和80 min时条带灰度值差异极显著（P＜0.01），表明时间长短对bta-miR-377条带分布有影响，电泳中小片段的出现需较长时间；电压分别为100 V和80 V时条带灰度值差异显著（P＜0.05），表明电压大小对bta-miR-377表达有影响；凝胶浓度为2.5%、时间为80 min、电压为80 V时，bta-miR-377条带表达效果最好，灰度值最高，与电泳结果一致。

3 结论与讨论

近年来，miRNA的研究备受关注，运用灵敏、精确、快速的技术检测miRNA表达具有重要意义[11]。相比于Nothern blot和微阵列技术，琼脂糖凝胶电泳技术具有快速简便、成本低、特异性强的特点，后续可用于高通量检测，其已被广泛应用于检测miRNA表达中[12]。本研究在反转录过程中采用茎环结构法对bta-miR-377引物序列进行特异性延长，解决了其序列较短难以检测表达的问题，该方法相比于加尾法[13]，具有成本低、效率高、特异性强等优点，普遍用于miRNA研究中。李卫振等[14]采用茎环法设计siRNA序列特异性引物，利用RT-PCR技术成功检测出哺乳动物体内抗病毒siRNA表达水平；高克俭等[15]利用茎环结构特异性引物反转录miRNA，并利用环介导等温扩增技术（LAMP）检测出单细胞中miRNA的表达水平；HU等[16]采用Stem-loop RT-PCR法分析了棉花中Gh-miR156和Gh-miR159的特异性表达，推动了棉花中miRNA的研究。本研究结果表明，茎环结构法设计获得的引物能够有效鉴定bta-miR-377，此方法可行。

王杰等[17]利用RT-PCR技术分析miR-18和miR-224在原发性肝细胞癌（HCC）和癌旁组织中的差异表达量，设置凝胶浓度为2.0%、100 V 20 min条件下进行电泳，并对电泳条带进行光密度分析，结果表明，miR-18和miR-224在HCC中的表达量显著高于癌旁组织；高雯华等[18]对小鼠双侧海马中的miRNA-101半定量检测时，利用凝胶浓度为2.5%、80 V 30 min条件下进行；张金梅等[19]利用半定量RT-PCR对不同时间冷胁迫下金橘中miRNA的差异表达进行鉴定时，PCR产物在凝胶浓度为1.5%、80 V 20 min条件下进行琼脂糖凝胶电泳，并通过比较条带强弱以确定miRNA在不同时间下的表达情况。以上研究表明，半定量RT-PCR可用于miRNA表达的鉴定，但在不同组织中检测所需电泳条件不同，因此需对miRNA表达条件进行不断优化。本试验针对miRNA片段小的特点，首先对凝胶浓度进行优化；高电压使缓冲液温度升高导致DNA变性或降解，条带泳动过快出现弥散，或时间过短片段不能完全分离或集中现象，通过优化电源电压和电泳时间，试验结果显示，凝胶浓度2.5%、80 V 80 min为bta-miR-377分离的最佳条件，该条件下条带集中清晰，无弥散现象。

灰度分析是一种根据灰度值大小对所测样品中目的蛋白表达量高低进行定量分析的方法，具有分析快、结果直观的特点，一般数值在0～255[20]。杜珍武等[21]利用Image J软件对DNA的灰度值与DNA含量关系进行分析，在相同面积和像素数下，对电泳条带750 bp平均灰度值分析发现，DNA含量为50.0、66.8、83.5、100 ng时，与相应的灰度值呈正向线性关系，即DNA含量越高，灰度值越高；沈海滢等[22]对不同直径毛细管中血清甲胎蛋白灰度值进行分析，在不同抗体浓度和一定曝光时间下，大内径的毛细管中灰度值大，血清甲胎蛋白含量高，表明灰度值可用于分析核酸表达量。本研究在凝胶浓度为2.5%、电压100 V、时间60 min时灰度值为86.111；凝胶浓度为2.5%、电压100 V、时间80 min时灰度值为170.766，在电泳条件最佳时的灰度值为200.867，此时灰度值明显高于其他条件，说明此条件下bta-miR-377表达量最高，可在该条件下进行后续试验。

本研究优化了检测bta-miR-377表达的琼脂糖凝胶电泳条件，当凝胶浓度为2.5%、电源电压为80 V、电泳时间为80 min时可有效分离鉴定btamiR-377，利用简便方式高效精准鉴定其在牛下丘脑中有表达，为后续深入研究奠定了基础；然而对bta-miR-377在牛下丘脑中功能和调控方式还不清楚，仍需进一步研究。