崀山脐橙皮黄酮提取物对酪氨酸酶的抑制活性研究

◎ 周新崇，易 灿，刘进兵

（邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000）

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1，tyrosinase）是黑色素合成和果蔬褐变的关键酶，在植物中使果蔬发生酶促褐变，在人体内代谢异常则会引起部分色素沉着性皮肤病，还与人类的黑色素瘤和白化病等疾病有直接关联[1-2]。化学合成的酪氨酸酶抑制剂具有一定毒副作用，因此从植物源中寻找酪氨酸酶抑制剂受到研究者关注。

邵阳市新宁县崀山片区产的崀山脐橙，地处赣南-湘南-桂北脐橙产业优势带，自20世纪70年代大力推广种植脐橙以来，已经成为全国较大的脐橙生产区[3]。脐橙皮中含有丰富的黄酮类物质，具有抗氧化、抗炎症、降血压等活性[4]。本文拟通过酶抑制动力学试验、荧光光谱技术，研究崀山脐橙皮提取物的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物对酪氨酸酶的抑制活性及其抑制机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

崀山脐橙皮粉（采摘自湖南省邵阳市新宁县白沙镇白沙园艺场的12月成熟期的崀山脐橙果，取其果皮在60 ℃恒温干燥至恒重，粉碎过60目筛）；蘑菇酪氨酸酶（美国Sigma公司）；左旋多巴胺（L-DOPA，纯度≥99%，Johnson Matthey化学公司）；曲酸（纯度≥97%，上海阿拉丁生化科技有限股份公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

101-1AB烘箱（天津市泰斯仪器有限公司）；SF-130型高速中药粉碎机（中南制药机械厂）；ME203E型分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；MCR-3常压微波化学反应器、SHB-ⅢA循环水式真空泵（巩义市中天仪器科技有限公司）；IKA HB10旋转蒸发仪（德国IKA公司）；PT-3502C全波长酶标分析仪（北京普天新桥技术有限公司）；Cary Edipse荧光光谱仪（美国安捷伦科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 崀山脐橙皮黄酮的提取与萃取

称取崀山脐橙皮粉20 g，放入三口烧瓶中，在料液比为1∶40（g∶mL）、乙醇浓度为75%、微波功率为480 W、提取温度60 ℃的条件下，分3次提取4 min，每次间隔10 min，将提取物抽滤，用75%乙醇溶液洗涤滤饼3次，滤液减压浓缩至浸膏[5-6]。

所得浸膏用温水200 mL制成混悬液，依次分别用石油醚400 mL、乙酸乙酯400 mL、正丁醇300 mL萃取，每次添加100 mL有机溶液萃取，直到有机层接近无色，分别合并不同上层有机溶剂萃取液，并收集下层水相，四相分别减压浓缩干燥，称重后所得浸膏分别用75%乙醇溶液定容到50 mL容量瓶中，得到崀山脐橙皮石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水的四相萃取物，待用[7-10]。

1.3.2 对酪氨酸酶活性抑制效果分析

本文参照文献略作修改[10-12]。从崀山脐橙皮石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相各母液中，用移液枪精确配制成初始质量浓度1 000 mg·mL-1的溶液，试验时配制成浓度依次为 62.5 mg·L-1、125.0 mg·L-1、250.0 mg·L-1、500.0 mg·L-1和 1 000.0 mg·L-1的不同极性部位溶液和曲酸对照液[10]。

在总体积为220 µL，磷酸盐溶液（pH 6.8，0.5 mol·L-1）为缓冲液的体系中，96孔板中依次加入150 µL磷酸盐缓冲液、20 µL待测样品（其中空白组20 µL磷酸盐缓冲液），10 µL酪氨酸酶溶液（0.05 mg·mL-1），在37 ℃下气浴恒温孵化15 min后，加入 20 µL L-DOPA 溶液（10 mmol·L-1），使用酶标仪测量在475 nm下的溶液吸光值，曲酸进行同样处理。酪氨酸酶抑制率按式（1）计算：

式中：B为空白吸光度；S为样品吸光度。

1.3.3 对酪氨酸酶的抑制动力学分析

试验参照的方法略微修改，在与1.3.2相同的试验条件下，分别加入不同浓度的样品溶液，固定酪氨酸酶的浓度为0.05 mg·mL-1，测定反应体系中ΔOD随底物L-DOPA浓度增加的变化趋势，以底物质量浓度的倒数为x轴和反应速率的倒数为y轴绘制Lineweaver-Burk曲线，根据直线交点的位置判断崀山脐橙皮取物对酪氨酸酶的抑制类型[13]。

1.3.4 荧光淬灭试验

崀山脐橙皮提取物对酪氨酸酶的荧光淬灭试验参照的方法略微修改[10,14-15]。荧光光谱的试验条件设置为激发波长280 nm，激发和发射的狭缝宽度均为5 nm，扫描的速度为中速，扫描电压为高压800 V。加入2 mL的0.01 mg·mL-1的酪氨酸酶溶液，测定其荧光光谱后，再逐次加入200 mg·L-1的崀山脐橙皮正丁醇相溶液，每次100 µL，混合均匀后静置2 min，分别在25 ℃、31 ℃和37 ℃温度下扫描各样品在290～500 nm处的发射光谱，判断其荧光猝灭类型。

2 结果与分析

2.1 崀山脐橙皮提取物对酪氨酸酶活性的抑制效果

以曲酸为对照物，崀山脐橙皮不同萃取层对酪氨酸酶活性的抑制作用如图1所示。崀山脐橙皮四相萃取物对酪氨酸酶活性的抑制效果随质量浓度增大而增强，并呈量效关系，抑制能力大小为正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞水相，由SPSS软件分析得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相和曲酸抑制酪氨酸酶活性的IC50值分别为469.141 mg·L-1，409.298 mg·L-1，358.150 mg·L-1，475.724 mg·L-1和113.555 mg·L-1。

图1 曲酸和崀山脐橙皮各萃取层对酪氨酸酶的抑制率图

2.2 崀山脐橙皮提取物对酪氨酸酶抑制动力学分析

由2.1可知，崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶抑制效果最好，所以选择此相进行抑制动力学分析。由图2可知，随着崀山脐橙皮正丁醇相的质量浓度增大，直线斜率增大，且直线几乎相交于横轴的一点，米氏常数Km基本不变，最大反应速率Vmax减小，由此推断崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶的抑制作用类型为非竞争抑制[10]。根据Lineweaver-Burk方程（表1）计算得正丁醇相的Km值约17.448 mmol·L-1。以各直线与纵坐标的交点对崀山脐橙皮正丁醇相质量浓度进行二次作图得到图3，通过这条直线与横轴的交点可求得崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶的抑制常数KI为398.68 mg·L-1。

图2 崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶抑制类型图

图3 崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶抑制作用Lineweaver-Burk图

表1 崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程表

2.3 崀山脐橙皮正丁醇相提取物对酪氨酸酶的荧光淬灭作用

当温度25 ℃时，不同浓度崀山脐橙皮正丁醇相溶液对酪氨酸酶的荧光发射光谱如图4所示。随着崀山脐橙皮正丁醇相浓度（a ～ e 为 0 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1和 40 mg·L-1）增加，酪氨酸酶的荧光发射峰的强度不断降低，说明产生荧光猝灭[14]。

2.4 崀山脐橙皮正丁醇相提取物对酪氨酸酶的荧光猝灭机理

根据Stern-Volmer方程进一步分析崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶的荧光猝灭机制[15]，通过F0/F对[Q]作图，见图5，得出25 ℃、31 ℃、37 ℃下的猝灭常数Ksv（表2），虽然随着温度升高，Ksv值增大，但Kq大于2×1010L·mg-1·s-1（最大扩散碰撞猝灭速率常数），表明崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶的荧光猝灭机制属于静态型[13]。

图5 崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶荧光猝灭的Stern-Volmer图

表2 崀山脐橙皮正丁醇相提取物与酪氨酸酶相互作用的Stern-Volmer方程表

3 结论

本文采用微波辅助法提取崀山脐橙皮有效成分，并依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，测试了不同相萃取物体外抑制酪氨酸酶活性，优选活性较好的正丁醇相进行酶抑制动力学评价、荧光光谱分析。结果表明，崀山脐橙皮正丁醇相以非竞争抑制的形式与酪氨酸酶相互作用；荧光光谱分析表明，崀山脐橙皮正丁醇相对酪氨酸酶是静态型猝灭，酶浓度增大，猝灭作用增强。本文的研究成果为崀山脐橙皮的综合利用提供了参考，以更好地服务乡村振兴战略。