奶粉中金黄色葡萄球菌定量检测盲样考核结果与分析

◎ 张 华，姜 庆，吴 迪，张 新

（临沂市检验检测中心，山东 临沂 276000）

引起食源性疾病的致病菌很多，金黄色葡萄球菌是其中非常重要的一个，金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧食源性病原体，能够在7.0～48.5 ℃、pH 4.2～9.3和NaCl浓度为0%～15%的这些外在因素中广泛存在，且金黄色葡萄球菌很容易从各种食物中分离出来，如牛奶、乳制品、肉类和鸡肉等，从而严重威胁着人们的身体健康[1-2]。根据《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[3]，其中九大类食品分别对金黄色葡萄球菌的限量进行了要求，充分体现了金黄色葡萄球菌在食品安全检验中是非常重要的一个指标。

盲样考核是为了验证实验室检测能力，确保日常检测结果的准确可靠而必须进行的一项质量控制活动。2021年8月，临沂市检验检测中心参加了由山东省食品药品检验研究院组织的食品安全承检机构奶粉中金黄色葡萄球菌的定量检测的盲样考核活动，结果满意，现将试验过程及结果进行分析。

1 材料与方法

1.1 样品

盲样考核样品1份，编号为NFJP1606；在棕色西林瓶内有0.5 g白色球状样品，避光储存于-20 ℃内；样品中的含量水平为0～1.0×106CFU·g-1。

1.2 培养基及试剂

Baird-Parker琼脂，批号：190713；亚碲酸钾卵黄增菌液，批号：201130；脑心浸出液肉汤（BHI），批号：190419；血平板，即用型培养基，批号：210725；冻干兔血浆，批号：201214；磷酸盐缓冲液（贮存液），批号：201108；营养琼脂，批号：200526，所使用的培养基都从北京陆桥技术股份有限公司购买且在保质期内；革兰氏染色试剂盒；批号：6106229，从广东环凯微生物科技有限公司采购。

1.3 标准菌株

阴性对照菌为表皮葡萄球菌[CMCC（B）26069]，从中国医学细菌菌种保藏管理中心采购；阳性对照菌为金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），从中国工业微生物菌种保藏管理中心采购。

1.4 设备和耗材

ZGP-2270隔水式恒温培养箱（上海智诚公司）；MLS3780高压蒸汽灭菌器（日本三洋公司）；TE212-L电子天平（赛多利斯公司）；微量移液枪（Gilson公司）；AC2-4S1生物安全柜（ESCD）、显微镜（日本奥林巴斯公司）；XH-C快速混匀器（江苏金怡仪器科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 样品前处理

依据《2021年承检机构盲样考核作业指导书》，从-20 ℃冰柜中取出盲样考核样品NFJP1606，将西林瓶在室温下放置5 min。在生物安全柜中进行无菌操作，样品已按照0.5 g精确称量后分装，无需再称量取样，计算时按照0.5 g计算。加入4.5 mL灭菌PBS复溶后得到1∶10稀释度的样品匀液，然后进行10倍系列稀释，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀释梯度，每个稀释度都使用新的无菌吸头吸取前一稀释度的样品匀液，且吸头不能碰触样品匀液液面。

1.5.2 样品接种

根据此次盲样考核作业指导书，样品需至少进行3次重复测量，样品中的含量水平为0～1.0×106CFU·g-1。选择10-1～10-6稀释度的样品匀液。依据GB 4789.10—2016中第二法对样品进行接下来的检测。从每个稀释度取0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的样品混匀液各加入到3块B-P平板里，且每个稀释度分别做3次重复，然后用无菌涂布棒涂布B-P平板，尽量在平板培养基中间区域涂布，避免涂布到平板边缘。

1.5.3 培养

为了使涂布的样品混匀液吸收，先把B-P平板正置，放在36 ℃培养箱里培养1 h，观察到液体吸收后，再将B-P平板倒置，培养直至48 h。按照GB 4789.10—2016第二法的要求，对B-P平板上的典型菌落及可疑菌落进行计数，再进行血浆凝固酶试验，按照阳性比例确定最终的计数结果[4]。

2 结果与分析

按照盲样作业指导书和GB 4789.10—2016的要求，从10-1～10-6稀释度进行取样检测，发现NFJP1606样品中，在10-1、10-2、10-3稀释度的平板里生长出只有一种特征的典型菌落，没有其他可疑菌落生长。统计Baird-Parker平板上的典型菌落数见表1。

表1 Baird-Parker平板金黄色葡萄球菌典型菌落计数结果表

从B-P平板上挑取典型菌落划线接种于血平板后，血平板上均出现了典型的金黄色葡萄球菌可疑菌落特征，对其进行革兰氏染色镜检与血浆凝固酶试验，结果见表2。

表2 选择性分离平板菌落特征与鉴定结果表

金黄色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征符合金黄色葡萄球菌菌落形态的典型特征。革兰氏染色镜检结果为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄串状，也有个别2个或3个球菌相连，无芽孢和荚膜，直径大小为0.5～1.0 μm；接种于血平板上，是金黄色圆形菌落、光滑凸起湿润、周围有溶血圈，符合金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落形态的典型特征。

血浆凝固酶试验必须设置对照试验，以金黄色葡萄球菌标准菌株作为阳性对照，表皮葡萄球菌标准菌株作为阴性对照，以无菌生理盐水作为空白对照。阳性对照培养3 h后凝固，阴性对照和空白对照培养6 h后仍未凝固[5]。盲样考核样品NFJP1606的典型菌落在培养3 h后全都凝固，判定为阳性结果。最终确认结果为 8.0×103CFU·g-1。

3 结论与讨论

本次盲样考核样品，奶粉中金黄色葡萄球菌定量检测的 B-P平板计数结果为8.0×103CFU·g-1，Z值小于2，为满意结果。由此可见该实验室具备金黄色葡萄球菌定量检测能力。

目前，食品安全国家标准要求的金黄色葡萄球菌检验项目基本上都是定量检验，金黄色葡萄球菌的定量检测是实验室进行质量控制盲样考核的一项重要项目，有利于实验室发现问题，从而改进工作，提高实验室检测水平，有效控制和判断实验室的检验检测能力[6]。因此，在进行盲样考核等试验过程中，以下问题应该引起注意。①对接收到的样品要认真进行检查，确认是否完整，发现问题及时沟通。②试验前认真阅读作业指导书，作业指导书往往会对本次盲样考核的样品、试验方法、结果记录等会有特别要求，如本次盲样考核要求样品每个稀释度做3次重复，和国家标准不一样。③试验前做好准备工作，包括仪器设备的校准、试运行，培养基试剂是否齐全；有条件可以购买指控样品进行预试验，提前发现问题并进行解决。④盲样考核试验要求非常精确，可以找一位经验丰富的监督员，特别是对于新手而言，参加盲样考核活动的机会少，防止出现操作失误，影响考核结果。⑤定量检测项目一般表明样品范围，可多做几个稀释度，确保结果准确，特别是在制作稀释梯度时，9 mL的稀释液要用无菌缓冲液分装到无菌试管里，防止梯度稀释液多少不均匀，影响结果的准确度。⑥Baird-Parker琼脂平板的状态对试验结果影响较大，因此要使Baird-Parker平板表面保持干燥，发现Baird-Parker平板表面有水滴时一定要使平板表面完全干燥后，再进行涂布。⑦要尽快涂布Baird-Parker平板上的菌液，同时涂布棒在平板中间区域涂布，不要碰触平板边缘，避免引起菌落蔓延生长。⑧完成试验后，因为涂布液含有奶粉不容易吸收，可先将平板正放在培养箱（36±1）℃培养1 h，等样品匀液吸收后翻转平板，倒置培养。⑨做好对照试验，做血浆凝固酶试验时，阳性对照、阴性对照和空白对照必须同时做好，按照标准要求每30 min观察1次，观察6 h。

盲样考核能使实验室管理者和实验人员对实验室的仪器设备和人员的检验能力有一个客观的认识，是实现实验室质量控制的科学有效的技术方式，有利于实验室自身能力的提高和检验检测结果准确性、可靠性的提升。