某中药育发液在体外微核试验中的遗传毒性研究

熊明朋，刘宁，龚玮，刘波

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

据不完全统计，近年来随着激烈的社会竞争、电子设备使用率的增加以及染发烫发的流行，中国脱发人口已远超2 亿，防脱育发类产品已越来越受追捧。浙江某公司生产的育发液主要由丹参、苦参、何首乌、防风、人参根等提取物组成，其在减少油脂分泌的同时，也能改善毛囊的生理状态，促使毛母细胞恢复生发的功能，从而促进头发的再生，但是其遗传毒性并未见相关报道。遗传毒性试验用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的供试品体内和体外的试验，其方法有多种，其中体外哺乳动物微核试验可用于检测有丝分裂细胞暴露于供试品期间或之后致染色体断裂和/或诱发非整倍体的能力，以评价供试品致突变的可能性。本试验将中国仓鼠肺细胞株（CHL）暴露在一定浓度的育发液下进行体外微核试验，评价育发液的安全性。

1 实验材料与方法

1.1 主要试剂

育发液（浙江某公司生产，批号：20191101），环磷酰胺（CP）、丝裂霉素C（MMC）、秋水仙素、胰酶、小牛血清均购自Sigma 公司，肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B（cytoB）购自大连美仑生物技术有限公司，姬姆萨染液购自雷根生物有限公司，MEM 无血清培养基、MEM 完全培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

酶标仪（赛默飞世尔科技公司），BX63 双人共览荧光显微镜（奥林巴斯株式会社），电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，二氧化碳恒温培养箱（赛默飞世尔科技公司），细胞计数器（上海睿钰生物科技有限公司），离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 细胞及代谢活化系统

CHL 细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司，大鼠肝S9购自瑞德肝脏疾病研究（上海）有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 S9 活化系统的制备取大鼠肝S91.25 mL，分别加入0.40 mol/L 的MgCl20.20 mL、1.65 mol/L 的KCl 0.20 mL、葡萄糖-6-磷酸17.91 mg、氧化型NADP 30.62 mg，最后用MEM 无血清培养基补足至10 mL。

1.4.2 对数生长期细胞的准备取对数生长期的CHL细胞，PBS 液洗涤3 次，弃去洗涤液，胰酶消化后，调整为1×105个/mL，备用。

1.4.3 供试品浓度的确定取育发液50 μL 加入9.95 mL MEM完全培养基溶解，配成5.000 μL/mL的溶液，再用MEM 完全培养基稀释成2.500、1.250、0.625、0.313 μL/mL 的系列浓度。

在含对数生长期细胞的96 孔板中，加入活化系统S9或不加入，接种于含上述5 种浓度梯度的供试品及阴性对照组（MEM 完全培养基），每组设4孔，吹打成细胞悬液，置37 ℃，5%二氧化碳恒温培养箱培养3 h，弃去原培养基，加入新鲜MEM 完全培养基，继续培养24 h 后，每孔加入20 μL 浓度为5 g/L 的MTT 溶液，继续培养4 h 后弃去孔内液体，加入150 μL 的DMSO，置振荡器上振荡10 min，在酶标仪上双波长（570 nm、630 nm）测定吸光度，并计算相对倍增数（RPD）。RPD=受试物组细胞倍增数/阴性对照组细胞倍增数×100，细胞毒性=100 -RPD。

1.4.4 体外细胞微核试验［1-2］（1）培养3 h 方案。在含对数生长期细胞的接种板中，加入适量MEM 完全培养基后，当加入活化系统S9时，各孔加入3 种梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供试品、阳性对照物（60 μg/mL CP）、阴性对照物（空白MEM 完全培养基），每组1 孔；当不加入活化系统S9时，各孔加入3 种梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供试品、阳性对照物（0.6 μg/mL MMC、1.0 μg/mL 秋水仙素）、阴性对照物（空白MEM 完全培养基），每组设2 孔，吹打成细胞悬液，置37 ℃，5%二氧化碳恒温培养箱培养3 h，弃去原培养基，加入新鲜MEM 完全培养基和cytoB，继续培养24 h 后收集细胞，并进行消化、低渗、固定、滴片、染色，显微镜下各组观察2 000 个双核细胞，计算微核细胞率。微核细胞率=具有微核的双核细胞数/双核细胞数。

（2）培养24 h 方案。在含对数生长期细胞的接种板中，加入适量MEM 完全培养基和cytoB，不加入活化系统S9，各孔加入3 种梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供试品、阳性对照物（0.4 μg/mL MMC）、阴性对照物（MEM 完全培养基），每组设2 孔，吹打成细胞悬液，置37 ℃，5%二氧化碳恒温培养箱培养24 h，弃去原培养基，加入新鲜MEM 完全培养基和cytoB，继续培养24 h 后收集细胞，并进行消化、低渗、固定、滴片、染色，显微镜下各组各观察2 000 个双核细胞，计算微核细胞率。

1.5 统计学方法

实验数据处理采用Excel 2010 软件，使用SPSS 19.0 软件作χ2检验，将样品各剂量组微核细胞率与阴性对照进行比较，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 供试品溶解情况

各浓度的供试品在MEM 完全培养基中未见沉淀。

2.2 供试品细胞毒性

供试品细胞毒性见表1，供试品在有活化系统和无活化系统的情况下，其细胞毒性均小于10%。

表1 供试品细胞毒性结果

2.3 体外哺乳动物细胞微核试验结果

体外哺乳动物细胞微核试验结果见表2，供试品组在有活化系统和无活化系统情况下，与阴性对照相比差异无统计学意义（P＞0.05），阳性对照组与阴性对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 体外哺乳动物细胞微核试验结果

3 讨论

本研究所使用的育发液主要由丹参、苦参、何首乌、防风、人参根等提取物组成，卷柏、何首乌，丹参等药材配伍经常用于促进头发生长和治疗脂溢性脱发［3-4］。尽管何首乌、丹参在成品胶囊中被证实无遗传毒性［5-6］，苦参在一种水溶液中无明显致突变作用［7］，人参粉剂也未显示有遗传毒性［8］，但是卷柏、防风以及该育发液中药提取物按照一定比例配伍，并按一定工艺加工的成品的安全性并未见相关报道。根据《化妆品注册备案管理办法》，育发类产品属于特殊用途化妆品，其遗传毒性试验是必做项目之一，因此，本试验选择体外哺乳动物微核试验研究其遗传毒性。

在有活化系统或无活化系统的情况下，CHL 细胞暴露在不同浓度的育发液下，细胞毒性均远小于50%，说明在该系列浓度下，供试品没有毒性，在以后的试验中，我们将考虑增加供试品浓度，直至最高剂量能引起50%～60%的细胞毒性以及其他形式的遗传毒性研究［9-10］。在同一个剂量组下，使用活化系统的剂量组，相比于不使用活化系统的剂量组，供试品的细胞毒性更低，但相差不大，表明育发液中某些物质不排除经活化系统发生了改变，能促使毒性降低，但在体外哺乳动物细胞微核试验，使用活化系统的剂量组，相比于不使用活化系统的剂量组，供试品的微核率更高。并且，同一个剂量组下，不管是剂量组还是空白对照组，培养24 h 方案比培养3 h 方案的微核率都有稍许增加，暗示随着接触时间的增加，细胞本身的自然突变能力增加，而非供试品诱导突变的能力增加。另外，供试品各剂量组在有活化系统和无活化系统情况下，与阴性对照相比差异无统计学意义（P＞0.05），阳性对照组与阴性对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），表明供试品在5.000 μL/mL、2.500 μL/mL、1.250 μL/mL 的情况下，体外对哺乳动物细胞致突变性为阴性。

本研究表明，某中药育发液在5.000 μL/mL、2.500 μL/mL、1.250 μL/mL 的情况下，体外对哺乳动物细胞没有致突变性。