铅锌复合胁迫对小黑杨、黑青杨生长及生理的影响1)

易嘉欣 马晓雨 孙国语 庞忠义 苏伟斌 张芳平 张春华 李开隆

(东北林业大学，哈尔滨，150040) ( 辽宁省新民市机械林场) ( 黑龙江省富锦县林业局) ( 东北林业大学)

随着社会经济迅速发展，工业“三废”大量排放和农药化肥大量施用，造成大量土壤污染物累积[1]。据统计，每年排放到环境中的重金属Cd约为2.20×104吨、Pb约为7.83×105吨，Zn约为1.35×106吨，我国耕地受污染总面积达2 000万hm2，粮食年产量减少1 200多万吨，经济损失高达200亿元[2]。Pb是长期存在土壤中危害性极高的重金属污染物之一，对植物、动物、人类都有很高的毒性[3-4]。过量的Pb会破坏叶绿素酸脂还原酶活性，影响氨基-γ-酮戊酸合成，导致植物叶绿素质量分数减少[5]。当马蔺(Irislactea)生存环境中Pb摩尔体积分数达到6 mmol·L-1时，生长会受到显著抑制[6]。自然界中Pb通常与Zn矿共存。Zn是植物生长所必需的微量元素，植物缺Zn会引起生理病害，过量Zn会改变叶绿素合成时几种酶肽链的正常构型，通过抑制酶活性阻碍叶绿素合成，对植物产生毒害作用[7]。多立安等[8]研究认为，锌胁迫对早熟禾种子萌发和幼苗生长有低质量浓度促进、高质量浓度抑制的作用。因此，研究重金属Pb、Zn复合胁迫对植物生长及生理的影响，对植物修复土壤重金属污染具有重要意义。

杨树(PopulusL.)分布范围广，适应能力强，对干旱、盐碱、寒冷、瘠薄、营养亏缺等逆境均有一定程度的抗性，因此，发展杨树人工林很大程度解决了我国用材林稀缺等问题[9]。黑青杨(Populuseuramericana‘N3016’×P.ussuriensis)是美洲黑杨(P.euramericana‘N3016’)和大青杨(P.ussuriensis)的杂交品种，树干通直、生长迅速、材质优良，是营造纸浆林等用材林的优良树种[10]。小黑杨(P.simonii×P.nigra)是中国林科院1959年以小叶杨(P.simonii)和欧洲黑杨(P.nigra)为亲本杂交培育的新品种，是我国东北地区主要的绿化及用材树种[11]。因此，本研究以小黑杨、黑青杨为试验材料，研究杨树对重金属胁迫的适应性和耐受程度，对于我国干旱、寒冷、瘠薄、重工业地区杨树的培育及利用具有重要意义。

目前对杨树重金属逆境胁迫的研究主要集中于单一胁迫[12-13]，复合胁迫研究较少。因此，本研究以铅锌复合胁迫处理小黑杨和黑青杨，了解其在铅锌共同胁迫下的反应机理，为今后土壤重金属污染修复、我国抗逆栽培技术、杨树常规育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小黑杨、黑青杨穗条由佳木斯市富锦县林业局东风岗林场提供。

1.2 试验方法

在东北林业大学国家白桦良种基地中进行盆栽试验。将1年生小黑杨、黑青杨穗条扦插于营养钵，每个营养钵扦插1株，土壤基质为草炭土和沙子，以4∶1比例充分混匀。培养温度控制在22～30 ℃，相对湿度为50%～70%。自然光条件培养苗木至1 m左右，选择长势一致的健康苗木进行重金属胁迫处理。将Pb(NO3)2和ZnSO4按比例与去离子水混合，再按对应配比稀释，使Pb2+与Zn2+形成4个质量浓度梯度，分别为100/200、200/400、400/800、800/1 600 mg·L-1，均匀施加相同体积于对应处理的营养钵中，每3 d浇灌1次，以浇水为对照，每个处理设15株重复。于9月初测生长指标并取样，每个单株选取从上至下第3、4片功能叶，每个处理选取10～12片功能叶以便于完成3次试验重复，将取下的植物样本放入液氮中保存，带回置于超低温冰箱中待测。

脯氨酸(PRO)质量分数采用酸性茚三酮法测定[14]，丙二醛(MDA)质量摩尔浓度采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定[14]，过氧化氢酶(CAT)采用紫外分光光度法测定[15]，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[15]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NTB)光化还原法测定[15]。可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝G-250法测定[16]，可溶性糖质量分数采用蒽酮比色法测定[16]，叶绿素质量分数采用80%丙酮萃取法测定[16]，每个处理指标设3次生物学重复。

1.3 数据处理

采用Excel软件对原始数据进行统计，采用SPSS 22.0软件、Duncan多重比较法进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 铅锌复合胁迫对小黑杨和黑青杨幼苗生长的影响

不同质量浓度的铅锌复合胁迫对小黑杨和黑青杨苗高、地径的影响结果见表1。随着胁迫质量浓度增加，小黑杨苗高、地径均呈降低趋势，苗高、地径均在高质量浓度(Pb2+/Zn2+为800/1 600 mg·L-1)胁迫时，抑制程度最大，分别较对照组降低了34.62%、23.45%；铅锌复合胁迫质量浓度高于100/200 mg·L-1时，苗高、地径均与对照组差异显著(P<0.05)。黑青杨苗高、地径均随着复合胁迫质量浓度增加而降低，苗高在100/200、200/400、400/800、800/1 600 mg·L-1质量浓度处理时分别比对照降低了14.19%、21.62%、30.41%、41.89%，与对照组差异显著(P<0.05)。地径在铅锌复合胁迫质量浓度为100/200 mg·L-1时比对照下降了9.68%，与对照组差异不显著；在铅锌复合胁迫质量浓度为200/400、400/800、800/1 600 mg·L-1时分别减少了16.42%、16.67%、18.75%，与对照组差异显著(P<0.05)。由此说明，铅锌复合胁迫抑制杨树生长，胁迫质量浓度越大，抑制作用越强。

2.2 Pb、Zn复合胁迫对小黑杨和黑青杨叶片叶绿素质量分数的影响

不同质量浓度胁迫对小黑杨和黑青杨的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、总叶绿素质量分数影响见表2。在铅锌复合胁迫质量浓度为100/200 mg·L-1时，小黑杨叶绿素a、叶绿素(a+b)、总叶绿素质量分数分别比对照增加了11.39%、3.73%、4.00%；当Pb2+/Zn2+>200/400 mg·L-1时，小黑杨和黑青杨总叶绿素质量分数随着胁迫质量浓度增加而减少；当铅锌复合胁迫质量浓度最高时，即Pb2+/Zn2+为800/1 600 mg·L-1时，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、总叶绿素质量分数分别比对照降低了23.47%、55.83%、30.49%、36.00%。黑青杨总叶绿素质量分数随着胁迫质量浓度增加，呈先增后减趋势，在铅锌复合胁迫质量浓度为200/400 mg·L-1时，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、总叶绿素质量分数达到峰值，分别为5.00、1.09、6.09、0.61 mg·g-1，较对照增加了10.38%、17.20%、11.33%、10.91%；当铅锌复合胁迫质量浓度为800/1 600 mg·L-1时，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、总叶绿素质量分数达到最低值，分别为2.55、0.68、3.22、0.27 mg·g-1，较对照减少了43.71%、26.88%、41.13%、50.91%。结果表明，小黑杨总叶绿素质量分数的峰值先于黑青杨出现。

表1 不同质量浓度铅锌复合胁迫下小黑杨、黑青杨苗高、地径生长比较

表2 不同质量浓度铅锌复合胁迫下小黑杨和黑青杨叶片叶绿素质量分数比较

2.3 铅锌复合胁迫对小黑杨和黑青杨渗透作用调节机制的影响

2.3.1铅锌复合胁迫对小黑杨和黑青杨可溶性蛋白质量分数的影响

小黑杨和黑青杨可溶性蛋白质量分数随着重金属复合胁迫质量浓度增加，呈先升后降趋势(表3)。小黑杨可溶性蛋白在铅锌复合胁迫质量浓度为100/200 mg·L-1时达到峰值，为57.68 mg·g-1，较对照上升了24.74%；在铅锌复合胁迫质量浓度为800/1 600 mg·L-1时达到最低值，为25.51 mg·g-1，较对照降低了44.83%。黑青杨可溶性蛋白在铅锌复合胁迫质量浓度为200/400 mg·L-1时达到峰值，为54.5 mg·g-1，较对照上升了20.18%；Pb2+/Zn2+>200/400 mg·L-1时，黑青杨可溶性蛋白随着胁迫质量浓度增加而降低，且低于对照；在铅锌复合胁迫质量浓度为800/1 600 mg·L-1时出现最低值，为28.48 mg·g-1，较对照组降低了37.25%。

表3 不同质量浓度铅锌复合胁迫下小黑杨、黑青杨可溶性蛋白质量分数比较

2.3.2铅锌复合胁迫对小黑杨和黑青杨可溶性糖质量分数的影响

随着铅锌复合胁迫质量浓度增加，小黑杨和黑青杨中可溶性糖质量分数均呈先升后降趋势(表4)。小黑杨可溶性糖质量分数在铅锌复合胁迫质量浓度为200/400 mg·L-1时达到峰值，为17.54 mg·g-1，较对照增加了49.19%；黑青杨可溶性糖质量分数在铅锌复合胁迫质量浓度为100/200 mg·L-1时达到峰值，为27.45 mg·g-1，较对照增加了63.37%。小黑杨、黑青杨可溶性糖质量分数均在铅锌复合胁迫质量浓度为800/1 600 mg·L-1时达到最低值，分别为10.69、9.96 mg·g-1，较对照降低了9.04%、40.74%。不同质量浓度复合胁迫下小黑杨、黑青杨可溶性糖质量分数较对照差异显著(P<0.05)。小黑杨在铅锌复合胁迫质量浓度高于为800/1 600 mg·L-1时、黑青杨在铅锌复合胁迫质量浓度为400/800 mg·L-1时，其可溶性糖质量分数低于对照，说明高质量浓度铅锌复合胁迫阻碍了小黑杨、黑青杨可溶性糖生成。

表4 不同质量浓度铅锌复合胁迫下小黑杨、黑青杨可溶性糖质量分数比较

2.3.3铅锌复合胁迫对小黑杨和黑青杨脯氨酸质量分数的影响

如表5所示，在铅锌复合胁迫质量浓度为100/200 mg·L-1时，小黑杨PRO质量分数为3.01 μg·g-1，与对照差异不显著；高于该质量浓度时，与对照差异性显著(P<0.05)。黑青杨PRO质量分数在铅锌复合胁迫各质量浓度处理时均差异性显著。当铅锌复合胁迫质量浓度为800/1 600 mg·L-1时，小黑杨、黑青杨PRO质量分数均达到最大值，分别为11.10、16.69 μg·g-1，是对照处理的3.39倍、3.40倍。小黑杨、黑青杨PRO质量分数随处理质量浓度增大而增加，各胁迫质量浓度处理时均高于对照。由此说明，逆境胁迫破坏了小黑杨和黑青杨的渗透能力，加快PRO的生成及累积。

表5 不同质量浓度铅锌复合胁迫下小黑杨、黑青杨脯氨酸质量分数比较

2.3.4铅锌复合胁迫对小黑杨和黑青杨细胞膜透性的影响

不同铅锌复合胁迫质量浓度处理时，小黑杨和黑青杨MDA质量摩尔浓度均较对照差异显著(P<0.05)，各质量浓度之间也差异显著(表6)。在铅锌复合胁迫质量浓度为800/1 600 mg·L-1时，小黑杨、黑青杨MDA质量摩尔浓度上升最快，分别为12.88、10.31 nmol·g-1，是对照处理的1.91倍、2.22倍。小黑杨、黑青杨中MDA质量摩尔浓度均随着铅锌复合胁迫质量浓度增加而增加，说明铅锌复合胁迫质量浓度越高，MDA质量摩尔浓度越高，对小黑杨、黑青杨细胞膜破坏能力越强，对植物损害越严重。

表6 不同质量浓度铅锌复合胁迫下小黑杨和黑青杨丙二醛质量摩尔浓度比较

2.4 铅锌复合胁迫对小黑杨和黑青杨抗氧化酶活性的影响

2.4.1铅锌复合胁迫对小黑杨、黑青杨幼苗过氧化物酶的影响

小黑杨、黑青杨中POD活性均随着复合胁迫质量浓度增加呈先升后降趋势(表7)。各胁迫质量浓度处理时，小黑杨、黑青杨POD活性差异性显著(P<0.05)。小黑杨、黑青杨POD活性均在铅锌复合胁迫质量浓度为400/800 mg·L-1时上升最快，且在该质量浓度处达到峰值，分别为224.67、199.93 U·g-1·min-1，是对照的2.50倍、2.27倍。当铅锌复合胁迫质量浓度为800/1 600 mg·L-1时，小黑杨、黑青杨POD活性均降低，较胁迫质量浓度为400/800 mg·L-1时降低了35.07%、27.54%。不同胁迫质量浓度下，POD活性均高于对照，说明重金属复合胁迫激发了杨树幼苗抗氧化酶活性，但未超出调控阈值。

表7 不同质量浓度铅锌复合胁迫下小黑杨、黑青杨过氧化物酶活性比较

2.4.2铅锌复合胁迫对小黑杨、黑青杨过氧化氢酶活性的影响

随铅锌复合胁迫质量浓度增加，小黑杨、黑青杨中CAT活性呈先升后降趋势(表8)。小黑杨、黑青杨CAT活性均在铅锌复合胁迫质量浓度为400/800 mg·L-1时达到峰值，分别为402.7、465.12 μmol·g-1·min-1，较对照增加了51.98%、63.96%。当铅锌复合胁迫质量浓度为800/1 600 mg·L-1时，CAT活性开始下降但高于对照，比对照增加了16.06%、26.69%。小黑杨各质量浓度胁迫间CAT活性差异性均显著，各质量浓度胁迫下黑青杨CAT活性较对照差异性均显著(P<0.05)。小黑杨、黑青杨CAT活性在达到峰值后，继续增加胁迫质量浓度，CAT活性显著下降，说明高质量浓度的复合胁迫对杨树机体损伤严重，导致过氧化氢酶合成受到阻碍。

2.4.3铅锌复合胁迫对小黑杨、黑青杨超氧化物歧化酶活性的影响

小黑杨、黑青杨中SOD活性均随重金属复合胁迫质量浓度增加呈先升后降趋势(表9)。在铅锌复合胁迫质量浓度为200/400 mg·L-1时，SOD活性增长趋势最大且达到峰值，分别为52.15、56.27 U·g-1，较对照增加了84.71%、74.87%，高于该质量浓度则显著下降。小黑杨、黑青杨在各质量浓度复合胁迫下较对照差异性显著(P<0.05)，说明铅锌复合胁迫显著影响了小黑杨和黑青杨体内的超氧化物歧化酶活性。

表9 不同质量浓度铅锌复合胁迫下小黑杨、黑青杨超氧化物歧化酶活性比较

3 结论与讨论

3.1 铅锌复合胁迫抑制小黑杨和黑青杨生长

铅锌是主要的重金属环境污染物质，当植物体内铅锌质量浓度超过一定阈值会对植物产生毒害。杨玲等[17]研究表明，铅锌复合胁迫下，狗牙根(Cynodondactylon)幼苗根长、苗高、鲜质量等生长指标均随着处理质量浓度的增加而降低。高秉婷等[18]研究表明，低质量浓度的Zn2+胁迫对白三叶(TrifoliumrepensL)等4种草的生长影响不大，当Zn2+质量分数高于800 mg·kg-1时，会显著抑制白三叶等4种草正常生长。本研究中，随着铅锌复合胁迫质量浓度增加，小黑杨、黑青杨的苗高、地径较对照整体呈下降趋势，说明复合胁迫质量浓度越大，抑制杨树生长的作用越强。

3.2 铅锌复合胁迫影响小黑杨和黑青杨叶片叶绿素质量分数

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，其质量分数代表植物通过光合作用获取能量和有机物的程度，是反映植物叶片光合作用的1个重要指标[19]。本研究中，小黑杨叶绿素质量分数的峰值出现在Pb2+/Zn2+为100/200 mg·L-1胁迫时，黑青杨的峰值出现在Pb2+/Zn2+为200/400 mg·L-1胁迫时，继续提高胁迫质量浓度，小黑杨、黑青杨叶绿素质量分数均低于对照，说明铅锌质量浓度过高会抑制叶绿素的形成，阻碍了小黑杨和黑青杨叶片进行光合作用。这与姜贝贝等[20]研究中高质量浓度重金属胁迫抑制长鬃蓼(PolygonumlongisetumDe Br.)光合作用的结果一致。

3.3 铅锌复合胁迫引起小黑杨和黑青杨渗透调节物质累积

可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸都是植物体内重要的渗透调节物质，与植物体内有机物转化、养分循环、植物代谢及抗性等密切相关。姜贝贝等[20]研究表明，低质量浓度Cu2+、Zn2+、Pb2+胁迫时，长鬃蓼可溶性糖、可溶性蛋白都有明显的积累，但随着质量浓度增加，可溶性糖、可溶性蛋白质量分数降低。郑世英等[21]发现，随Pb2+、Cd2+胁迫质量浓度提高，MDA质量摩尔浓度呈逐渐上升的趋势，棉花中MDA质量摩尔浓度与遭受Pb2+、Cd2+胁迫的质量浓度呈正相关。本研究发现，Pb2+/Zn2+为100/200 mg·L-1胁迫时，小黑杨、黑青杨可溶性糖、可溶性蛋白质量分数增加，随着质量浓度增加，其质量分数逐渐降低，说明小黑杨、黑青杨在受到逆境胁迫时，为了维持细胞正常代谢，会促进可溶性糖和可溶性蛋白合成，由此提高植物对逆境胁迫的耐受性。小黑杨、黑青杨PRO质量分数、MDA质量摩尔浓度均随着铅锌复合胁迫质量浓度增加而持续增加，随着胁迫质量浓度增大，植物体内产生大量自由基，引起植物自由基清除物质—脯氨酸大量生成并累积，同时自由基作用于脂质，发生过氧化反应，导致MDA大量生成[22]。MDA质量摩尔浓度越高，植物受损伤越严重，PRO质量分数越高，抗逆境胁迫能力越强，这与刘蕊[23]的研究结果相似。

3.4 铅锌复合胁迫激活小黑杨和黑青杨抗氧化酶活性

逆境会使植物形成复杂的抗氧化系统，过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶是清除活性氧自由基的主要抗氧化酶，用于维持植物细胞在逆境胁迫中正常工作。14种禾本科牧草对重金属Pb2+耐受性的研究发现，植物POD、SOD、CAT活性先增后减[24]。保志娟等[25]研究结果表明，铅锌复合胁迫下，低质量浓度的Zn能激活烟草(NicotianatabacumL.)SOD及POD活性，高质量浓度的Zn则抑制POD活性。本研究表明，随着复合胁迫质量浓度增加，小黑杨、黑青杨POD、SOD活性均呈先升后降趋势，较对照差异显著且均高于对照，可见，Pb2+/Zn2+为100/200 mg·L-1时对2个杨树品种的POD、SOD活性有一定的促进作用；处理至质量浓度为Pb2+/Zn2+>400/800 mg·L-1时，POD、SOD活性显著下降，说明小黑杨、黑青杨对重金属胁迫有较高的耐受性；但当胁迫强度超出所能调控的阀值范围，自我修复系统受到破坏，导致POD、SOD活性下降，这与王婷[26]研究结果基本一致。小黑杨和黑青杨幼苗CAT活性在各质量浓度胁迫下均高于对照，说明铅锌复合胁迫激发了其CAT活性。Pb2+/Zn2+为400/800 mg·L-1胁迫时，小黑杨和黑青杨CAT活性达到峰值，而高于此质量浓度则CAT活性显著降低，说明高质量浓度胁迫对2个杨树品种机体损伤严重，导致过氧化氢酶合成受到抑制。与Alonso-Blázquez et al.[27]研究结果一致。

总体来说，重金属铅锌4种复合质量浓度胁迫下，小黑杨、黑青杨幼苗在生长、生理方面有着显著差异。综合所有指标来看，Pb2+/Zn2+<200/400 mg·L-1胁迫时，2个杨树品种叶绿素质量分数、可溶性糖质量分数、可溶性蛋白质量分数、MDA质量摩尔浓度、PRO质量分数、CAT活性、SOD活性、POD活性均有一定程度增加，说明小黑杨和黑青杨能够依靠自身保护酶系统的调节，形成重金属自我抵御机制以适应Pb2+/Zn2+<200/400 mg·L-1质量浓度胁迫。

重金属复合胁迫对植物的影响与植物品种、重金属复合类型、质量浓度配比、胁迫时间、作用部位等诸多因素有关。相同重金属对不同植物影响程度及周期存在差异，作用部位也可能导致结果出现差异，重金属间可能存在协同或拮抗作用，因此，重金属复合污染这个复杂、多元化的问题，还有待更深入的研究。