基于药代动力学特征定量评估金丝桃素肝肠首过效应

苏 远 张蒙蒙 姚婷婷 赵 倩 王佳佳 章礼久 方海明

金丝桃素（Hyp）是贯叶连翘中的一种天然生物活性物质，药理活性具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用[1]。此外，由于Hyp具有疏水性强、与细胞膜亲和力强、毒性低、光氧化活性高等优点，被认为是光动力疗法的一种很有前途的光敏剂，在黑色素瘤等肿瘤光动力学治疗方面的潜能越来越受到关注和重视[2]。慢性丙型肝炎患者连续口服0.05 mg·kg-1及0.1 mg·kg-1Hyp，共8周，血浆药物浓度-时间曲线下面积和药物峰浓度均进行剂量标准化，呈现出非剂量依赖性[3]。关于Hyp低BA的原因及潜在原因尚不清楚。已知，首过代谢是导致药物口服BA低的重要因素。肝脏代谢是大多数药物口服首过代谢的主要发生部位。肠道黏膜同肝脏一样，存在药物代谢酶和药物转运蛋白，影响药物吸收和代谢，产生肠道首过效应。肠道首过效应在口服药物生利用度中的作用亦越来也受到关注。本课题前期建立的经十二指肠（id）、门静脉（ipv）以及外周静脉（iv）置管建立的给药通路动物模型能够定量评估药物肝脏和肠道首过效应[4-5]。而肝脏首过效应还是肠道的首过效应对Hyp生物利用度的具体影响程度尚不清楚。为此，本研究利用本课题组前期建立的成熟的动物给药模型探讨经十二指肠、门静脉以及外周静脉途径给予不同剂量的Hyp的药动学特征及定量估算其肝脏与肠道首过效应，为提高Hyp口服BA提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 Hyp标准品为成都普瑞法公司产品（纯度98%，NO.548-04-9），实验所用甲醇，乙腈均为色谱纯。

1.2 主要实验仪器 日本岛津LC-20AT型HPLC色谱仪以及LC色谱工作站。上海沪西WH-2微型漩涡混合仪、东京理化公司的氮吹仪等。

1.3 肠道-血管给药通路动物模型的建立 ①实验动物：Wistar大鼠，平均体质量为（250±5）g，雌雄各半，由安徽肥东长临河公司提供。②术前准备：实验前，大鼠禁止进食食物至少12 h，但可以自由饮水。大鼠经3 mL·kg-1的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后并仰卧位固定，参照前期文献方法[4-5]，分别在大鼠颈动脉、id、ipv以及iv进行置管，留置管末端用肝素帽封管并注射少量125 U·mL-1肝素钠生理盐水抗凝防止管腔堵塞。

1.4 Hyp药代动力学检测

1.4.1 血浆Hyp的HPLC检测方法学建立 参照文献并适当改进[6]。①大鼠血浆Hyp样本前处理：参照文献[6]，精密取大鼠血浆0.1 mL，加入0.3 mL甲醇/吡啶（9∶1）混合液后，涡旋振荡1 min，14000 r/min离心3 min，取上清液，57 ℃氮气吹干，加入200 μL流动相复溶，再次涡旋振荡1 min，14000 r/min离心3 min，取上清液20 μL进样分析，HPLC检测。②色谱条件：参照之前文献[6]，LC-20AT型岛津HPLC分析系统包括自动进样器、荧光检测器、温控箱以及色谱工作站组成。色谱柱：Kromasil C18柱（5 μm，4.6×200 mm）；流动相：甲醇/乙腈/1%磷酸二氢钠=65/30/5；流速：1.0 mL/min；柱温40 ℃；荧光检测激发波长315 nm、检测波长590 nm；进样20 μL。

1.4.2 Hyp不同给药途径下药动学特征及肝脏-肠道首过代谢评估 每种给药途径分别设置低、中、高三个剂量组，每组6只大鼠。实验前夜禁食、自由饮水，经id给予Hyp（100 mg·g-1，200 mg·g-1，400 mg·kg-1，实验前用0.1%羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度）；ipv （50 mg·kg-1，100 mg·kg-1，200 mg·kg-1）和iv（50 mg·kg-1，100 mg·kg-1，200 mg·kg-1）给药，并且于给药前（0 min）及给药后1 min、5 min、10 min、20 min、40 min、60 min、90 min、120 min和180 min经颈动脉缺血0.3 mL。每个缺血时间点经颈动脉取血后，均经股静脉注射等量生理盐水。血标本经离心后取上清液-80 ℃保存，采取上述HPLC方法测定Hyp血药浓度。

1.5 数据处理与统计分析 血浆药物浓度-时间曲线（C-t）下面积（AUC）、半衰期（T1/2）、清除率（CL）等药动学参数采用DAS2.0药动学软件分析，达峰时间（Tmax）、峰浓度（Cmax）等根据实测值取平均值。BA、肝脏提取率（Eh）以及肠道提取率（Ei）参照文献方法计算[5-6]，即：BA=（AUCid/Doseid）/（AUCiv/Doseiv）；Eh=1-AUCipv/AUCiv；Ei=1-AUCid/AUCipv，其 中，AUCid为 经id途 径AUC值、Doseid为经id途径给药剂量；AUCipv为经ipv途径AUC值、Doseipv为经ipv途径给药剂量；AUCiv为经iv途径AUC值、Doseiv为经iv途径给药剂量。采用SPSS 19.0进行统计分析，剂量资料采取均数±标准差，One-Way ANOVA分析考察组间的差别，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同给药途径下Hyp药动学特征及肠道首过代谢评价

2.1.1 经静脉给予不同剂量的Hyp的C-t曲线及药动学参数分析 经外周静脉给予（50～200）mg·kg-1Hyp，其C-t曲线及药动学参数分别见图1和表1。由表1可见，各剂量间AUCiv值随Hyp药物剂量升高而升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），但剂量标准化后AUCiv值不呈剂量依赖性，T1/2、CL差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 经静脉给予不同剂量的Hyp药动学参数（n=6）

图1 静脉给予不同剂量的Hyp 药物浓度-时间（C-t）曲线（n=6）

2.1.2 经门脉给予不同剂量的Hyp的C-t曲线及药动学参数分析 经门脉给予（50-200）mg·kg-1Hyp，其C-t曲线曲线及药动学参数分别见图2和表2。由表2可见，AUCipv值随Hyp药物剂量升高而升高，差异具有统计学意义，但剂量标准化后AUCipv值不呈剂量依赖性；与同剂量外周静脉AUC值相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。各剂量间T1/2、CL差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 经门脉给予不同剂量的Hyp药物浓度-时间（C-t）曲线（n=6）

表2 经门脉给予不同剂量的Hyp药动学参数（n=6）

2.1.3 经十二指肠给予不同剂量的Hyp的C-t曲线及药动学参数分析 经十二指肠给予（100-400）mg·kg-1Hyp，其C-t曲线及药动学参数分别见图3和表3。由表3可见，id给予不同剂量Hyp，均约在20 min内达到血药峰浓度，AUCid值随Hyp剂量升高而升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），但显著低于同剂量门脉及外周静脉AUC值，剂量标准化后AUCid值呈剂量非依赖性。各剂量间Tmax、T1/2、CL/F值差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 经十二指肠给予不同剂量的Hyp药动学参数（n=6）

图3 经十二指肠给予不同剂量的Hyp药物浓度-时间（C-t）曲线（n=6）

2.2 id给予不同剂量Hyp的BA、Eh和Ei值分析 id给予（100～200）mg·kg-1Hyp后，其BA、Eh和Ei见表4。

表4 id给予不同剂量Hyp的BA，Eh和Ei值分析（n=6）

3 讨 论

口服给药由于其方便性和副作用小，是目前临床中最常用的给药途径，但口服给药面临的问题是存在生物利用度，甚至一些药物因口服生物利用度低而导致应用受限制。口服给药生物利用度低除了药物肠道吸收以及药物剂型的影响因素以外，经历显著的首过效应是主要原因。明确药物首过效应的发生部位以及可能的机制对于提高药物生物利用度具有重要价值。

肝脏和肠道是首过效应主要发生部位，但进行药物首过效应研究过程中如何甄别肝脏和（或）肠道首过代谢部位以及作用程度存在困难。本课题组前期建立经肠道、门静脉以及外周静脉置管建立的肠道血管给药途径的动物模型能够定量评价药物肠道首过效应发生部位及进行机制研究，该方法成熟可靠、重复性好。利用该模型，我们定量评价了不同药物的肝脏和肠道首过代谢[4-8]。通过前期的研究，本课题组掌握了通过HPLC测定大鼠血浆中Hyp含量，该方法专属性好、灵敏度高、可靠性强[6]。本研究中，我们经IVAP大鼠模式给予同剂量Hyp，十二指肠、门静脉以及外周静脉Hyp的AUC值随剂量增加而增加，剂量标准化以后AUC值不呈现剂量依赖性，但十二指肠AUC值显著低于门静脉和外周静脉AUC值，差异具有显著统计学意义。AUCipv略低于AUCiv，但差异无统计学意义，增加Hyp剂量不能显著提高绝对生物利用度。Hyp经历了显著的首过效应，肝脏提取率占17%左右，而肠道提取率占88%～94%，肠道是Hyp首过效应主要发生部位。

对某些药物而言，肠道首过效应起主要作用[9-10]。因此，肠道首过效应在低口服生物利用度中的作用不容忽视，且抑制肠道CYP3A4代谢酶及P-糖蛋白转运体酶活性可能是提高口服药物生物利用度的有效途径[4，6]。有研究证实[10]，贯叶金丝桃的活性成分能诱导细胞色素P450（CYP）3A4酶及肠道P-糖蛋白（P-gp）的转运活性，改变经胃肠道吸收药物的代谢过程，影响药物口服生物利用度。因此，是否可以使用抑制CYP3A4代谢酶及P-gp活性的药物，提高金丝桃素口服生物利用度，我们后续将进行这方面研究。