龟水仙中毒继发阿氏肠杆菌和甘蔗科萨克氏菌感染的诊断

张雪芳 ， 黄 薇 ， 马 文 ， 缴 莹 ， 梁贝贝 ， 吕艳丽,3

(1.中国农业大学动物医院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.北京农业职业学院 ， 北京 海淀102499 ；3.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

水仙是一种春季开花的植物，其花、叶和球茎中都含有石蒜碱，具有强烈催吐作用，在人、犬和猫都有误食中毒的报道[1-3]，症状包括颤抖、癫痫、腹泻、过度流口水、呕吐、心跳加快、呼吸困难和心律失常等[4]。对于中毒动物，目前尚无特效治疗方法，主要是支持治疗和对症治疗。阿氏肠杆菌广泛存在土壤、植物根系等外界环境中，是一种条件致病菌，可从人的呼吸道、尿液、伤口和肝脏移植病人中分离出[5-6]，在兽医临床，已有引起水牛和黄牛死亡的报告[7-8]。甘蔗科萨克氏菌广泛存在与土壤和植物根系等环境中，尚不清楚是否可引起动物发病。

1 病例情况

苏卡达陆龟，7岁，8.6 kg，雄性。龟室内散养，每日泡水，可自行到阳台晒背，每日饲喂食物为蔬菜、水果和龟粮。主诉该龟在进食水仙后第3天出现呕吐和腹泻，呕吐物内包裹几块未消化的水仙球茎，在进食水仙球茎第9天后，患龟出现食欲废绝，精神沉郁，因此前来就诊。

2 体格检查

患龟背甲坚实，隆背Ⅰ～Ⅱ级[9]。患龟无力，可轻易打开口腔，口色淡粉，口鼻未见明显分泌物，会阴部干净。

3 实验室检查

3.1 血液采集 选用咪达唑仑0.5 mg/(kg·bw)肌内注射镇静[10]后，于左侧颈静脉采集血液1 mL，随即将其注入肝素锂抗凝管中用于红细胞压积(PCV)和生化检查，剩余少量血液制备3张血涂片。

3.2 血细胞分析 将血涂片进行瑞氏-姬姆萨染色，显微镜镜检并计数。高倍镜(400×)下，血涂片单层区域10个视野中白细胞(WBC)总数为8个，按照公式[10]WBC(个/μL) =(10个视野平均白细胞数)×402计算，白细胞数量为1 280/μL，即1.28×109/L(参考范围：4×109～10×109/L)，异嗜性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞占比分别为12%、8%、60%、4%和约16%。油镜下(1 000×)镜检可见红细胞大小不等，偶见多染性红细胞；异嗜性粒细胞细胞质呈蓝色，含有异常的紫色颗粒，提示中毒性变化(图1A)，部分单核细胞的细胞质中可见杆状细菌(图1B)。白细胞总数减少、单核细胞增多、白细胞出现中毒性变化，提示炎症反应[10]。毛细离心管吸取肝素锂抗凝血，用KUBOTA 3220离心机，10 000 r/min离心5 min，测量红细胞压积(PCV)，测得PCV为28%(参考范围：9%～32%)。

图1 龟的血涂片检查(瑞氏-姬姆萨染色，1 000×)

3.3 生化分析 将抗凝血高速离心分离获得血浆进行生化检查，结果如表1所示，患龟尿酸浓度显著升高，尿素轻度升高，提示肾损伤。

表1 生化结果

3.4 细菌分离培养与鉴定

3.4.1 细菌分离 分别取肝素抗凝血200 μL 接种于血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，可见血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上均有大量非单一细菌菌落生长，经分离纯化培养24 h，1号菌在血琼脂平板上为直径约1.5 mm、稍隆起的白色圆形菌落，表面光滑湿润，边缘整齐略透明，在麦康凯培养基上可见直径约1.5 mm、稍隆起的淡粉色圆形菌落、表面光滑湿润、边缘整齐。2号细菌在血琼脂平板上及麦康凯平板上与1号菌相似，但其颜色为灰黄色，且在血琼脂培养基和麦康凯培养基上分别呈现出比1号菌略宽的透明边界和更加淡粉色的边缘。显微镜下2种菌均为中等大小的革兰阴性杆菌。

3.4.2 16S rDNA序列分析和质谱鉴定 将2种细菌的纯培养产物送至北京擎科生物科技有限公司进行16S rDNA PCR扩增和序列测定，并将测序结果与GenBank数据库中的序列进行比对，结果显示，1号细菌核苷酸序列与分离自生菜叶子的阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae，登录号：CP007546.1)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae，登录号：AP024495.1)及自生产生物肥料的草莓根中分离的肠杆菌DB044株(Enterobactersp.，登录号：MK537360.1)16S rDNA的同源性均高达99.86%。2号细菌核苷酸序列测序结果与植物源性细菌甘蔗科萨克氏菌(Kosakoniasacchari，登录号：CP040677)DSM107661株同源性100%。2种细菌经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定，1号细菌为阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae，分值9.506)，2号菌与阪崎克洛诺杆菌(Cronobactersakazakii)匹配度最高，但分值仅为6.641。

综合分析16S rDNA测序结果和质谱鉴定结果，结合细菌的生长特征，判定1号细菌为阿氏肠杆菌，2号细菌为甘蔗科萨克氏菌(Kosakoniasacchari)。

4 诊断

根据病史、细菌培养和鉴定结果及血涂片和生化检查结果，本病例诊断为龟进食水仙中毒继发阿氏肠杆菌和甘蔗科萨克氏菌感染。

5 治疗和转归

使用复方甘草酸单铵解毒并保肝，选择拜有利[5 mg/(kg·bw)，隔日1次]抗感染，对于呕吐和脱水，进行乳酸林格体腔外注射补充，连续治疗2 d，患龟于就诊后第3天死亡。

6 讨论

食草陆龟摄入有毒植物在临床较为常见，但是否引起严重的临床病征，与龟的种类和其对不同有毒植物的耐受性以及进食有毒植物的量相关。本病例中体重5.8 kg的食草陆龟进食约0.5 kg的水仙球茎后出现食欲废绝和精神沉郁，提示水仙对陆龟有毒性作用。至食入后7 d才出现呕吐和腹泻等胃肠道症状可能与水仙中毒引起的胃肠道和肾损伤有关，也可能是水仙中毒和继发性细菌性败血症双重作用的结果。因为就诊当日在血涂片中发现了单核细胞胞内吞噬杆菌和异嗜性粒细胞中毒性变化，表明患龟出现了严重的菌血症，而生化结果显示患龟血清中尿酸含量显著升高，提示患龟出现了严重的肾损伤[10-11]。血涂片检查发现胞内吞噬菌后对全血进行了细菌培养，分离获得了阿氏肠杆菌和甘蔗科萨克氏菌2种肠杆菌科细菌，二者均广泛存在于土壤等外界环境中，其中阿氏肠杆菌也存人与动物的肠道中，是人和动物的条件致病菌，而后者是植物的内生菌，可促进植物的生长发育[12-13]。本病例所述为食草陆龟，日常生活中极易接触到本病例分离的2种细菌，因此，笔者认为患龟死亡的原因为水仙中毒继发阿氏肠杆菌和甘蔗科萨克氏菌感染所致。

致谢:中国医学科学院北京协和医院检验科侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，提供Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统对本病例的细菌进行鉴定。