人工感染吉氏巴贝斯虫后犬脾脏病理学变化

翟晓虎 ， 洪玉方 ， 姚大伟 ， 贺卫华 ， 于元晞 ， 张 斌 ， 刘宗平

(1.扬州大学兽医学院 ， 江苏 扬州 225009 ； 2.江苏农牧科技职业学院 ， 江苏 泰州 225300 ；3.南京农业大学动物医学院 ， 江苏 南京 210095)

犬巴贝斯虫病是巴贝斯属的虫体寄生于犬的红细胞内引起的一种严重的血液原虫疾病[1]。该病分布广泛，在热带、亚热带和温带地区特别严重[2]。目前在我国流行的犬巴贝斯虫主要为吉氏巴贝斯虫[3-4]。吉氏巴贝斯虫病临床表现为贫血、发热、黄疸、脾肿大、血红蛋白尿、可视黏膜苍白黄染等。研究表明吉氏巴贝斯虫感染后，外周血淋巴细胞增殖能力显著下降，CD3+T、CD4+T细胞占比降低,对机体免疫功能有明显的抑制作用[5]。脾脏是重要的外周免疫器官，在机体免疫系统的发生、成熟和免疫调节过程中具有重要作用[6]。巴贝斯虫感染后血脾屏障能滤过血液中衰老变性的、原虫感染的红细胞，另外巴贝斯虫感染会使宿主本身产生抗红细胞膜抗体，增加巨噬细胞对红细胞的吞噬作用，最终导致脾脏肿大[7]。目前的研究仅观察到吉氏巴贝斯虫感染后脾脏的肿大，然而脾脏具体存在哪些组织病理学改变却鲜有报道。因此，本试验采用人工感染建立犬吉氏巴贝斯虫病模型，在发病过程中采用B超检查脾脏大小的变化，剖检病死犬观察其脾脏病理表现，制备石蜡切片观察脾脏组织病理学变化，以期了解脾脏在抗吉氏巴贝斯虫感染过程中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫株和实验犬 吉氏巴贝斯虫，由本实验室保存，接种于试验犬保种。比格犬，购自江苏省青龙山动物繁殖场。

1.1.2 主要仪器设备 MYLABTM400 VET B型超声仪(意大利百胜医疗科技有限公司)，迈瑞Mindray BC-5000血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，Eclipse Ci光学显微镜[尼康仪器(上海)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 试验犬人工感染巴贝斯虫模型 头静脉采集吉氏巴贝斯虫保虫犬的血液30 mL(血涂片镜检红细胞染虫率约2%)，ACD抗凝。通过头静脉接种健康试验比格犬6只，每只犬接种含吉氏巴贝斯虫的血液5 mL。

1.2.2 血涂片镜检 试验犬接种前和接种后每3天采血，EDTA抗凝制备血涂片，瑞氏吉姆萨染色，镜检，观察吉氏巴贝斯虫虫体。

1.2.3 血常规检查 试验犬接种前和接种后每3天进行血常规检查。

1.2.4 PCR检测巴贝斯虫 试验犬接种前和接种后每3天取100 μL抗凝血，采用蛋白酶K消化、苯酚抽提、乙醇沉淀的方法提取血液中总基因组DNA，根据参考文献[3]所述方法通过PCR检测血液中的吉氏巴贝斯虫。

1.2.5 脾脏超声检查 试验犬接种前和接种后每隔7 天进行超声检查，测量脾脏大小。检查前试验犬禁食12 h，仰卧保定，从剑状突软骨后方剃毛，均匀涂布耦合剂，采用6.6 MHz探头进行脾脏扫查。在左侧腹部平行于肋弓后方1～2指宽处沿肋骨方前后左右移动探头，找到脾脏后横切脾脏并沿其走向向后滑动探头，找到脾门将图像冻结。然后继续向后移动探头，找到脾尾，转动探头使之纵切脾脏，冻结图像。脾门厚度测量：选取脾门静脉附近3个点(图1A中a、b、c)，垂直于脾脏被膜，测量脾脏壁层和脏层被膜之间的长度，然后取3个点的平均值。连续测量3 d取其平均值作为脾门厚度。脾尾厚度测量：于距离脾尾末端1 cm处做垂直于被膜的垂线，测量该处脾脏壁层和脏层被膜之间的长度(图1B中d)。连续测量3 d取其平均值作为脾尾厚度。

图1 脾脏大小测量方法

1.2.6 脾脏病理学观察 对病死犬进行剖检，观察病理剖检变化，特别是脾脏病理变化。将切下来的脾脏用10%福尔马林溶液固定、脱水，透明后制作常规石蜡切片。H.E.染色，光学显微镜下观察脾脏组织病理学变化。

2 结果

2.1 血涂片镜检 健康犬接种后最早第6天可在个别犬的血涂片中发现虫体，9～12 d可在所有犬的血涂片上观察到虫体(图2)，另外血涂片可见红细胞大小不均，形态不规则，异染性红细胞。

图2 血涂片镜检(接种后12 d)

2.2 血常规检查 结果如图3所示。健康犬接种后前2周血常规指标正常，红细胞总数(RBC)平均为(6.26±0.57)×1012/L，血红蛋白含量(HGB)平均为(141.2±27.7) g/L，红细胞压积(HCT)平均为(39.88±6.61)%。感染后15 d血常规指标开始出现异常，RBC、HGB、HCT开始下降，提示贫血，且3个指标变化趋势一致，直至感染后30 d降到最低，RBC平均为(1.95±0.51)×1012/L，HGB平均为(52.00±18.87)g/L，HCT平均为(19.94±6.69)%。此时犬只开始死亡，于感染后第31、36天和第42天分别死亡1只，死前红细胞总数均在1×1012/L以下，死亡率为50%，存活犬只血常规指标逐渐回升，但均仍处于严重贫血状态。

图3 感染后血常规指标变化

2.3 PCR检测 接种后第3天即可从血液中检测到吉氏巴贝斯虫目的基因片段，大小约为339 bp(图4)。

图4 吉氏巴贝斯虫PCR检测

2.4 脾脏超声检查 B超检查脾门和脾尾厚度，结果如图5所示，试验犬感染吉氏巴贝斯虫后，随着感染时间的延长脾脏逐渐肿大；接种前脾门厚度为(1.30±0.03) cm，感染29 d后增大到(2.12±0.16) cm，脾门厚度增加约0.63倍；接种前脾尾厚度为(0.45±0.03) cm，感染29 d后增加到(0.74±0.02) cm，厚度增加约0.64倍。感染后期触诊腹部即可明显感觉到质地坚硬的脾脏。

图5 感染后脾脏厚度变化

2.5 脾脏病理剖检及组织病理学变化 3只病死犬剖检可见皮肤及皮下组织黄染，脾脏显著肿大，比正常脾脏大1～2倍。脾脏被膜紧张，边缘钝圆(图6A、6B)。其中有2只犬脾脏可见梗死灶，切面呈楔形，黄白色，部分梗死灶中心为暗红色，外周黄白色(图6B)。

图6 感染后脾脏病理剖检变化

组织病理学观察可见梗死病灶内正常红髓、白髓结构消失，淋巴细胞、网状纤维结构弥漫性坏死，崩解，仅剩下极少量的淋巴细胞、中性粒细胞(图7A)。梗死灶以外的其他部分脾脏内红髓、白髓和边缘区之间的界限不清楚，白髓内有大量的红细胞，未见明显吉氏巴贝斯虫虫体，整个皮髓内均有大量中性粒细胞、单核巨噬细胞浸润，结缔组织增生，脾小梁增粗(图7B、7C)。

图7 感染后脾脏组织病理学变化 (H.E.染色，400×)

3 讨论

犬巴贝斯虫人工感染模型可以通过静脉给健康犬或脾脏切除犬接种含巴贝斯虫的血液而获得。脾脏切除的犬在感染后3～4 d即可从血涂片中观察到虫体[8-9]。本试验中的试验犬未进行脾脏切除，直接静脉接种，在接种后第6天即可从血涂片中观察到虫体，接种后第3天即可通过PCR检测到虫体基因组DNA。接种后第15天试验犬血常规中红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积逐渐降低，第30天降至最低，这些结果与其他试验性感染吉氏巴贝斯虫模型相似[8-9]。

脾脏是重要的外周免疫器官。脾脏中的白髓是机体发生特异性免疫的主要场所。红髓主要是免疫细胞发生吞噬作用的主要场所。边缘区是红髓和白髓的移行部，是抗原物质进入脾内与各种淋巴细胞接触的场所，也是脾内识别抗原、捕获抗原和诱发免疫应答的重要部位。脾脏边缘区有血脾屏障，能滤过血液中衰老变性、感染的红细胞[10]。巴贝斯虫感染通常会引起脾脏肿大，本试验通过连续B超检测脾门和脾尾大小，发现随着病程的延长，脾脏肿大的程度越发严重。当巴贝斯虫感染后，裂殖子通过配体粘附于宿主红细胞表面的目标受体，然后通过渗透和内化作用进入红细胞[11]。感染能导致红细胞机械性能下降和黏附性能增加[12]，被血脾屏障过滤，脾脏中的巨噬细胞发挥吞噬作用清除感染的红细胞和受损的红细胞，最终导致脾脏肿大[13]。因此病理剖检可见脾脏被膜紧张，边缘钝圆，体积增大。在组织病理学表现为脾脏充血，红白髓边界不清，中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润。

然而由于本试验中并没有对感染犬只给予抗巴贝斯虫药物治疗，致使脾脏持续性肿胀，最终导致脾脏中血液淤积，对脾脏造成不可逆的损伤，剖检发现脾脏梗死，脾脏组织大面积坏死，这种持续性脾脏肿大符合坏死性脾炎和慢性炎性脾肿的病理特点。脾脏的这些病理学变化与邓肯巴贝斯虫感染造成的脾脏病理损伤相似，感染邓肯巴贝斯虫的小鼠淋巴细胞显著减少、坏死，组织细胞增生，皮髓内充血[14]。

综上所述，吉氏巴贝斯虫感染初期脾脏肿大，属于急性炎性脾肿的病理变化，随着病程的延长，逐渐发展为坏死性脾炎和慢性炎性脾肿等病理变化，脾脏免疫功能将会受到影响。