复方白头翁散对鹅源鼠伤寒沙门菌分离株的体外抑制效果

王彦红 ， 高 尚 ， 王丽扬 ， 陈素娟 ， 许小琴

(1. 扬州大学兽医学院 ， 江苏 扬州 225009 ； 2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 ， 江苏 扬州 225009 ； 3.江苏省人兽共患病学重点实验室 ，江苏 扬州 225009)

沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌，不仅给人类健康带来了威胁，也给养禽业造成了巨大的经济损失。家禽在生产过程中，由于应用大量抗生素和化学性抗菌药物来预防和控制沙门菌病，造成了严重的细菌耐药性和禽蛋肉产品中的药物残留，越来越多的沙门菌已成为多重耐药菌[1-3]，多重耐药菌株的产生最终将危害人类的健康。此外，生物被膜增加细菌在外界环境中的生存能力，提高细菌耐药性及致病性[2]，增加食品污染的机会，成为人类沙门菌病暴发的重要原因。我国是养禽大国，多年的细菌流行病学调查试验数据显示，水禽中流行的沙门菌的优势血清型是鼠伤寒沙门菌，这些菌株具有较强的生物被膜形成能力[4]。

近年来，采用植物性药物控制沙门菌成为研究热点，如山奈酚可抑制鼠伤寒沙门菌的致病性作用[5]，黄连素能抑制鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成[6]。临床实践发现，包含多种成分组合方剂的治疗效果远远优于单种成分的方剂[7]。经典方如白头翁汤(Pulsatilla decoction，PD)最早见于张仲景的《伤寒论》，至今白头翁散仍是《中华人民共和国兽药典》(2015年版)收载的方剂。白头翁汤包含白头翁、黄连、黄柏和秦皮，这4种药物都具有抗细菌的活性成分，对大肠埃希菌和沙门菌等感染都具有良好的治疗效果[8-10]。有研究发现，黄芩抗菌性比黄连好，且不产生抗药性，主要成分黄芩苷能抑制细菌毒力和提高机体免疫应答能力，进而提高小鼠抗鼠伤寒沙门菌感染的能力，而且药物组方不同，效果具有差异性[8,11]。本试验所用复方白头翁散，在多年临床实践中有较好的效果。因此，本试验对送检鹅源病例进行沙门菌分离，调查该菌的流行情况、耐药性和生物被膜形成能力，检测复方白头翁散对临床鹅源鼠伤寒沙门菌分离株的抑菌效果和抑制生物被膜形成能力，为临床使用该方剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 胰蛋白胨和酵母粉，均购自英国OXOID公司；琼脂糖和核酸I型染液，均购自北京索莱宝科技有限公司；Taq酶和100 bp DNA Ladder等，均购自日本TaKaRa公司；缓冲蛋白胨水(BPW)，购自北京陆桥技术有限责任公司；法国科玛嘉显色培养基，购自上海欣中生物有限公司；抗菌药敏纸片和氯化镁孔雀绿(MM)增菌液，均购自杭州微生物试剂有限公司；沙门菌属诊断血清，购自宁波天润生物药业有限公司。

1.2 沙门菌的分离 2017年5月—2018年7月对各地送检至扬州大学动物医院的病例进行采样，临床样品中采集病死鹅的肝脏、胆汁和盲肠，加入BPW中，37 ℃培养18 h，再吸取BPW混合液50 μL，滴在MM固体培养基上，37 ℃培养24 h，挑取单个菌落，接种于法国科玛嘉显色培养基上，37 ℃培养24 h，挑取粉红色菌落，接种于麦康凯培养基(MAC)上进行纯培养。

1.3 沙门菌的PCR鉴定 将1.2中初步筛选的沙门菌疑似菌株采用高温裂解法提取细菌DNA，于-20 ℃冻存。按照国家标准《饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应(PCR)法》(GB/T 28642—2012)，以invA为鉴定基因进行PCR扩增。引物P1:TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC，P2:GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。invA基因预期目的条带大小为330 bp，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.4 血清型鉴定 采用玻片凝集法鉴定沙门菌血清型。先用沙门菌A～F群多价O抗原血清进行检测，然后用H抗原多价血清检测，分群后再用单因子的O抗原和H抗原血清检测。

1.5 药敏试验 选择18种药物，采用纸片扩散法检测药物敏感性，药敏试验判断标准参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI，2013年)。

1.6 鹅源鼠伤寒沙门菌生物被膜形成检测 参照参考文献[12]，采用96孔板结晶紫染色法检测生物被膜形成能力。使用鼠伤寒沙门菌标准株(S162)和临床分离菌制备菌悬液，每株菌株接种4孔，设置阴性对照。28 ℃培养72 h，弃上清液，PBS冲洗3次。0.4%结晶紫染色，33%冰乙酸洗脱生物被膜，测定550 nm处的吸光值，每株菌进行4次平行试验，取平均值，判定生物被膜形成能力。

1.7 复方白头翁散的组成与制备 复方白头翁散由5份白头翁、3份黄柏、4份秦皮、3份黄芩、8份连翘、3份苦参和5份甘草组成，混合打粉，再制成1.5 g/mL浓度的白头翁汤，4 ℃保存备用。

1.8 复方白头翁散最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 药液用LB培养液连续倍比稀释至1 500～2.93 mg/mL，96孔板每孔加入100 μL，相应孔加入鼠伤寒沙门菌株菌液100 μL，加入200 μL未加中药的无菌培养液和菌液分别作为阴性对照和阳性对照，设3个重复。37 ℃孵育24 h，检测MIC和MBC。

1.9 生物被膜形成体外抑制试验 将能够形成生物被膜的鼠伤寒沙门菌株的菌液100 μL接种到96孔板中，设3个重复，另加入100 μL倍比稀释的复方白头翁散(1 500～23.44 mg/mL)。加入200 μL未加中药的无菌培养液和菌液分别作为阴性对照和阳性对照，采用1.6中结晶紫染色法进行检测。

1.10 统计分析 采用IBM SPSS Statistics 22软件卡方检验分析，以P<0.05作为差异是否显著的判断标准。

2 结果

2.1 沙门菌的分离与鉴定 2017年5月—2018年7月，从临床采集患病鹅肝脏、胆汁和盲肠内容物共214份。通过细菌分离，分离菌DNA经沙门菌invA基因的PCR扩增，扩增产物经电泳，有50株分离菌株出现330 bp 目的条带，阳性率为23.4%。如表1所示，采集的样品中以扬州地区样品为主，共计114份，占比53.3%(114/214)，其中分离出29株沙门菌，分离率为25.4%(29/114)；镇江市分离率最高，达60.0%(6/10)，显著高于扬州、滁州、泰州和南通地区(表1)(P<0.05)。鹅源样品不同脏器组织中的沙门菌分离率无显著差异(P>0.05)(表2)。

表1 鹅样品来源和沙门菌分离率

表2 临床病鹅不同组织沙门菌分离率

2.2 沙门菌血清型鉴定 50株沙门菌分属8种血清型(表3)，分布比例为4%～60%，主要为B群血清型，因此鹅源沙门菌血清型分布较为广泛。其中，鼠伤寒沙门菌占60%，是调查区域内的优势血清型，其次肠炎沙门菌。

表3 沙门菌分离株血清型分布

2.3 药敏试验 药敏试验结果(表4)显示，50株沙门菌对阿莫西林、链霉素和多西环素耐药性较高，分别为44%(22/50)、38%(19/50)和38%(19/50)；其中，36株沙门菌对三类及三类以上抗菌药耐药，为多重耐药(MDR)菌株(表4)。30株鼠伤寒沙门菌耐药特点与50株沙门菌相似，对头孢噻肟、阿莫西林和多西环素耐药性较高，分别为40.0%(12/30)、36.7%(11/30)和36.7%(11/30)；但对氨基糖苷类药物耐药性较低，如阿米卡星、庆大霉素和卡那霉素耐药率分别为0、3.3%(1/30)和6.7%(2/30)；20株鼠伤寒沙门菌为多重耐药(表4)。

表4 沙门菌药敏试验

2.4 鹅源鼠伤寒沙门菌生物被膜形成检测 结晶紫染色法定量检测30株鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力，结果显示，26株菌株能够形成生物被膜，占86.7%(26/30),OD550值为(0.165±0.041)～(0.592±0.117)(表5)，其中18株鼠伤寒沙门菌成膜能力弱，8株成膜能力中等。

2.5 复方白头翁散MIC和MBC的测定 MIC和MBC检测结果显示：复方白头翁散提取液对30株鼠伤寒沙门菌均具有一定的抑杀效果(表5)。最小抑菌浓度(MIC)范围23.44～375.00 mg/mL，最小杀菌浓度(MBC)范围46.86～375.00 mg/mL。其中，40%菌株的MIC值为187.50 mg/mL，53.33%菌株的MBC值为375.00 mg/mL。

表5 鼠伤寒沙门菌的生物被膜形成及复方白头翁散的MIC和MBC

2.6 复方白头翁散抑制鼠伤寒沙门菌生物膜形成 复方白头翁散抑制鼠伤寒沙门菌生物膜形成能力结果显示，16倍稀释的提取液(93.75 mg/mL)对鼠伤寒沙门菌生物膜形成能力抑制效果最好，达到89.84%。

3 讨论

2017年5月—2018年7月从214份临床样品中分离出50株沙门菌，阳性率为23.4%。对10个市级区域送检病料分离情况进行分析，镇江地区送检病料中沙门菌分离率最高，达60.0%(6/10)，显著高于扬州、滁州、泰州和南通地区(表1)(P<0.05)。鹅源样品不同脏器组织中的沙门菌分离率无显著差异(P>0.05)(表2)。此次调查结果显示，这一地区的鹅源沙门菌以鼠伤寒沙门菌为主要优势血清型，与之前的报道一致[4]，但此次分离也有一些稀少的血清型出现，如里定沙门菌。这些特殊血清型沙门菌可能与场所环境、鸟类传播相关，例如李玉军等[13]在野鸟中分离出多种血清型的沙门菌。鹅生活环境与水鸟接触的机会多，更易感染和传播沙门菌[14-15]。

研究显示鼠伤寒沙门菌形成生物被膜能力较强。付玉勤[4]测定33株鼠伤寒沙门菌中有28株(84.84%)菌株能够形成生物被膜。孙化露等[16]对58株沙门菌生物被膜形成能力进行测定，结果显示18株鼠伤寒沙门菌中有15株(83.33%)能够形成生物被膜。在此次分离的30株鼠伤寒沙门菌中，有26株(86.7%)菌株能够形成生物被膜，与上述研究结果相似。

鹅作为一种重要的水禽，在我国畜禽养殖业中占有重要比重，其养殖模式增加了与其他动物和野禽接触的机会，为传播细菌和耐药菌株提供机会[14-15]。鼠伤寒沙门菌在鹅群中流行，容易形成生物被膜，可能会污染禽类相关食品，感染人类引起胃肠炎甚至类伤寒全身感染，是一种重要的人兽共患病病原。中药具有抑菌、副作用小和不存在药物残留的优点，为减少耐药菌株或多重耐药菌株的形成，减少药物残留和抑制细菌生物被膜形成，保障公共卫生安全，可以使用中药作为防控病菌感染的新途径。体外抑菌试验结果显示，复方白头翁散对鼠伤寒沙门菌有抑菌效果且可抑制生物被膜形成，MIC值可达23.44 mg/mL，MBC值可达46.87 mg/mL。其中，40%菌株的MIC值为187.50 mg/mL，53.33%菌株的MBC值为375.00 mg/mL，93.75 mg/mL浓度的复方白头翁散抑制生物被膜形成效果最佳，平均抑制率达到89.84%。复方白头翁散利用黄柏、黄芩和其他药物组合多种成分，协同作用达到抑菌效果并抑制细菌生物被膜形成，有望成为一种新型的绿色的防控药物。