CRISPR/Cas9系统敲除miRNA-182 和miRNA-155的初步研究

冯万有，杨燕燕，蒙丽娜，陈 春，何立珍，邓 凯，杨小芬，覃广胜，石德顺，*

(1.南宁师范大学环境与生命科学学院,广西 南宁 530001；2.广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室；3.广西壮族自治区食品药品检验所；4.中国农业科学院广西水牛研究所)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一组不编码蛋白质、长度22～25 nt内源性单链RNA，通过与mRNA的3'UTR碱基互补配对调控靶基因的转录。多项研究表明，miRNAs在哺乳动物基因表达网络中起着重要作用，而转录miRNA基因的突变显著影响卵母细胞发育、癌细胞增殖、干细胞分化和DNA损伤修复等。miRNA的基因或部分基因的内含子首先被RNA转录酶II转录形成初级miRNA(pri-miRNA)，随后在核中被Drosha-DGCR8处理成发夹结构的前体miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA与exportin-5蛋白结合，被运送至胞质中，经Dicer酶处理后形成成熟的miRNA双链，随后与Argonaute蛋白结合(也被称作Ago)形成RNA-诱导沉默复合体(RISC)。miRNA的一条链保存在RISC中，另一条链则被剔除RISC后迅速降解。关于两条链在RISC中如何分开，如何剔除还有待研究。miRNA-Ago复合物是RISC的作用中枢,通过miRNA与靶mRNA 3非编码区特异结合，指导RISC复合体下调靶基因表达。miRNA 5'端的6-8个核苷酸序列是miRNA和靶mRNA3'UTR结合的关键位点，因此称为“种子”序列。(图1A)

为了更好理解miRNAs的生物学和病理学意义，近年来开发了诸多技术，但基本受限于低效率和靶向特异性，如miRNA模拟物——化学合成的寡核苷酸，用于获得性功能验证试验，但其可能会扰乱内源miRNA通路。合成的与miRNA互补的寡核苷酸能可抑制miRNA的功能，但不可忽略的是靶向特异性。miRNA海绵技术，一个能有效专一性结合miRNA的新兴技术，也受到靶向特异性的制约。因此通过敲除miRNA种子序列或发夹结构方式将会是一个理想的选择。虽然基于传统同源重组的基因敲除方法已被用来在动物模型中敲除miRNA，但由于低效率(10-9-10-6/cell)，该方法很难被广泛应用。

目前的基因组编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN),转录激活样元件核酸酶(TALEN)和来自微生物适应性免疫系统CRISPR的RNA介导的cas9内切酶(CRISPR/cas9)、Cas12等。相比ZFNs和TALENs基于蛋白质-DNA的互用定位，CRISPR/cas9通过导向RNA靶向目标基因的操作更加便捷、特异性更强。此外，基于多条gRNA靶向不同基因位点可实现多基因同时敲除。首例利用CRISPR/cas9开展基因工程研究后，目前已发表了一系列关于CRISPR/cas9在多种真核生物的应用，但是这些研究更多的集中于蛋白质编码基因。本研究中，我们的阐明使用CRISPR/cas9介导的基因组编辑技术能高效敲除miRNA基因的种子或发夹结构，为探究目标miRNA的生物学功能提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 载体构建

人源化的cas9载体购买于Addgene(hCas9, Plasmid #41815)。gRNA载体中的U6启动子序列来自pSico载体(Addgene)，将其克隆到pEASY-T1载体(Transgene)，命名为pEasy-T1-U6(图1B)。通过在线gRNA设计筛选网站(http://www.rgenome.net/cas-designer/)完成gRNA的设计，其寡核苷酸序列送至生工生物工程股份有限公司(上海)合成(表1)，随后将其接连到以构建好的pEasy-T1-U6载体上。gRNA活性报告载体RGS(Jin-Soo Kim lab)是借鉴Hwang等人的研究方法，将合成的gRNA核苷酸互补链克隆到RGS载体上，表2是用到的相应寡核苷酸序列，其中值得提出的是这些寡核苷酸序列需包含5'-NGG-3'序列。

1.2 细胞培养和转染

将HEK293T细胞接种在添加10%的胎牛血清，2 mm谷氨酰胺(Life Technologies)，100 IU/mL的青霉素和100 μg/μL链霉素的DMEM基础培养基(Life Technologies)中，37℃×5%CO2培养箱中培养，按照Lipofectamine 2000(invitrogen, USA)的操作说明转染HEK293T细胞。

1.3 流式细胞分析

用PBS悬浮转染HEK293T细胞后使用BD C6流式细胞仪进行分析(BD Biosciences, USA)，收集共转gRNA、Cas9和RGS报告载体后的细胞，阴性对照为共转Cas9和RGS报告载体的细胞，单阳组分别为仅转染RGS(仅表达红色荧光)和eGFP-N1(表达绿色荧光)，每组实验重复三次。

1.4 T7E1试验

按照血液组织基因组试剂盒(QIAgen，Cat No.69504)的操作说明书提取转染后的HEK293T细胞基因组DNA，随后通过特异引物扩增出含有靶向编辑目标基因的序列，PCR程序是①94℃ 5min；②94℃30s，60℃30s，72℃ 40s，共35个循环；③72℃ 2 min，4℃保存。PCR产物煮沸10 min，在室温环境中缓慢冷却，形成异源双链DNA，37℃下T7EI(New England Biolabs)酶切1.5 h后，2%琼脂糖凝胶(Takara)电泳分析。

1.5 目标基因突变分析

按PMD18-T TA克隆试剂盒(TaKaRa，Cat No.D101A)说明书，链接PCR产物后将其转化到本实验室制备好的DH5α大肠杆菌感受态，37℃过夜培养后挑选单克隆菌株送至测序(BGI, Guangzhou)。分析等位基因与野生型等位基因是否发生突变，统计分析突变率(突变菌落数/挑选总菌落数)。

2 结果与分析

2.1 靶向miRNA的gRNA筛选与检测

miRNA敲除的难点在于miRNA序列的简短性和多样性。由于种子序列是关键功能区，而发夹结构又在Drosha核酸酶切割pri-miRNAs过程中起关键性作用，为了能够有效地敲除miRNA基因，因此选择miRNA的种子序列和发夹结构为gRNA位点(图1A，表 1)。为了检测gRNA的活性，我们首先使用带有mRFP基因，gRNA序列和移码的eGFP基因的报告载体(图1C，表2)，其工作原理是在不发生切割时，因为eGFP基因前存在终止密码子，转染细胞后仅表达mRFP。反之，若CRISPR/Cas9系统发挥功能，依靠细胞内DNA损伤后NHEJ修复机制，随机插入或缺失导eGFP基因前段的终止密码子移码突变，eGFP恢复表达。

按gRNA∶Cas9∶RGS=1∶1∶0.5比例转染体外培养的HEK293T细胞，48 h后观察发现大部分细胞表达mRFP，部分细胞表达eGFP，在未转染gRNA的细胞中，未见或极少见eGFP的表达(图2),表明筛选的gRNA能够有效地发挥靶向功能。选取活性高的gRNA2-miRNA-182和gRNA2-miRNA-155，分别与cas9载体按不同的比例转染后不同观察发现，表达eGFP的细胞数量存在差异(图3)，流失细胞统计分析表明表达eGFP的细胞数量存在显著差异(图4)。

图2 报告载体RGS与hCas9、gRNA的载体共转染HEK293T细胞后，RFP和GFP的表达

图3 将gRNA与hCas9按不同剂量比列转染48 h后荧光显微镜观察

2.2 流式细胞仪分析gRNA活性

酶的特异性和活性对反应条件具有显著的依赖性，酶量过大会显著增加脱靶率。限制酶用量，即减少Cas9-gRNA复合物量，是减少细胞非特异性敲除潜在策略。检测报告载体双荧光同时表达的HEK293T细胞，发现gRNA与Cas9的比值在2∶1到1∶16时，eGFP都有表达，然而我们发现gRNA2-miRNA-182:Cas9的比值为1∶4时，表达eGFP的细胞增加4倍，当gRNA2-miRNA-155 : Cas9 的比值为1∶4时，表达eGFP的细胞增加了28倍(图4)。因此结果可能表明，在人类细胞中gRNA的表达量可能是目标基因靶向编辑的限制性因素。

图4 流式细胞统计分析gRNA与hCas9按不同剂量比列转染后，eGFP表达效率

HEK293T细胞分别用编码hCas9的报告载体和以及靶向miRNA-182和miRNA-155基因的gRNA载体共转染，48h后荧光显微镜观察。未转染的gRNA细胞作为阴性对照。比例尺= 100μm。

分别统计每组表达红色荧光(RFP)和绿色荧光(eGFP)的细胞数量，然后计算eGFP/RFP的比值来确定不同转染比列对目标基因编辑的影响。

2.3 miRNA-182和miRNA-155的敲除

接下来，我们用筛选出来的gRNA敲除人miRNA-182和miRNA-155。按照gRNA∶Cas9=1∶4的转染剂量转染HEK293T细胞48 h，提取基因组DNA后经特异性引物(表3)扩增目标DNA片段，T7EI核酸内切酶验证发现每对gRNA都能够引起miRNA的突变(图5)。通过TA克隆测序验证突变类型，以及突变率，发现突变率在14.3%～20%之间，大多数的突变为短片段(<10bp)的缺失和插入，少数在断裂部分出现缺失和插入共存现象(图6)。

表3 PCR扩增目标基因时所需的引物序列

图5A 图5B

A图中条带1，2分别代表的是gRNA1-miRNA182，gRNA2-miRNA182；B图中条带1，2分别代表的是gRNA1-miRNA155，gRNA2-miRNA155；图中M带表的是DNA marker。

图6A

图6B

3 讨论

我们旨在探究是否可以利用CRISPR/Cas9技术靶向人类细胞中的miRNA。人类基因组中大约有20 000个蛋白质编码基因，约占全基因组的2.0%～2.5%，其余是包括miRNA在内的非编码RNAs。miRNA基因不像由成百上千个核苷酸组成的编码蛋白质基因那么典型，其基因序列因为相对简短，从而找到最佳的gRNA结合位点受到一定限制。我们的研究结果指出，能够利用CRISPR/Cas9技术特异高效的敲除miRNA种子序列或发夹序列，从而实现其突变。因为种子序列和发夹序列是抑制基因表达的关键区域，可成为候选敲除miRNAs的区域。我们也发现gRNA的活性可能是与目标基因的结合位点有关，这也表明，尽管我们遵循设计指南，但也存在其他因素影响CRISPR/Cas9技术的敲除效率，例如染色质结构，DNA修饰(如甲基化)，或其他DNA序列变异都是影响gRNA结合的因素。因为当前也实现是转染多条gRNA同时敲除多个目标基因或大片段删除感兴趣的基因。因此，结合当前的研究结果以及我们的研究发现，CRISPR/Cas9系统是实现靶向miRNA基因敲除的优异技术，在研究miRNA调控动物卵泡发育和卵母细胞的成熟、颗粒细胞增殖方面有一定的潜力。