异源CD151蛋白在H9c2细胞中的表达对PRRSV感染的影响

和伟程，李 菊，张潇文，刘方程，李琼毅，柏家林，*

(1.西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室, 甘肃 兰州 730030; 2.西北民族大学生命科学与工程学院)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)于1987年在美国首次报道，该病是由PRRS病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的猪群发生以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性传染病。其临床表现为母猪流产或早产或产木乃伊胎，仔猪出生后1周内死亡率超过25%，该病对全球养猪业造成了巨大的经济影响。PRRSV是一种有包膜的单股正链RNA病毒，与乳酸脱氢酶增高症病毒、马动脉炎病毒和猴出血热病毒同属动脉病毒科,其基因组全长约15kb，含有9个开放阅读框(ORF)。ORF1a和ORF1b编码14种不同的非结构蛋白(NSP1～NSP14)。ORF2a、2b、3、4、5、6和7分别编码糖蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、膜糖蛋白GP5、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)等结构蛋白。PRRSV进入宿主细胞由多种分子介导，主要涉及CD163、CD151、唾液酸粘附素(sialoadhesin,Sn)和波形蛋白(vimentin)等多种蛋白参与。CD163和Sn在PRRSV感染中的作用研究较多，但CD151在PRRSV感染中的作用尚不清楚。CD151是四次跨膜蛋白(Tetraspanin)超家族成员，与癌症增殖有关。研究已证明CD151参与提高细胞对PRRSV的易感性。然而这些研究都没有提供证据表明异源CD151蛋白是否能够支持PRRSV的复制增殖。2003年，David等人报道了一株源于棉鼠肺细胞的PRRSV易感细胞系(美国专利号20030219460)，这表明鼠源细胞可作为PRRSV增殖细胞系。本研究中我们使用大鼠心肌细胞系H9c2作为对象，研究异源蛋白CD151是否支持PRRSV的复制增殖。

1 材料和方法

1.1 细胞和病毒

MARC-145和H9c2细胞购自武汉中国典型培养物保藏中心(China center for type culture collection, CCTCC)。MARC-145细胞在含有10%胎牛血清(FBS, ThermoFisher Science, Logan, UT)的DMEM中培养，H9c2细胞在添加10%胎牛血清的MEM中培养。PRRSV毒株是西北农林科技大学周恩民教授惠赠的MARC-145细胞适应株SD16(GenBank: JX087437.1)，病毒滴度为106.0 TCID50ml-1。根据PFU=0.7×TCID50计算噬斑形成单位(Plaque forming unit, PFU)。

1.2 抗体

鼠抗人CD163单克隆抗体(mAb)和鼠抗猪CD169 mAb购自ABD(Abd Serotec, 英国牛津)，小鼠抗波形蛋白mAb购自Sigma(Sigma Aldrich Inc., St Louis, USA)，兔抗CD151多克隆抗体(pAb)购自Santa Cruz(Santa Cruz Biotechnology Inc., 美国德克萨斯州)，二抗Alexa Fluor-488偶联亲和山羊抗鼠IgG(H+L)和CyTM3偶联亲和山羊抗兔IgG(H+L)购自Jackson免疫研究实验室(美国宾夕法尼亚州Jackson ImmunoResearch Laboratory)。

1.3 RNA提取及RT-PCR

用TRIzol试剂(Takara, 中国大连)从H9c2和MARC-145细胞中提取总RNA，用高纯度病毒RNA试剂盒(德国罗氏)提取细胞培养上清液中病毒总RNA。用随机寡聚核苷酸引物、M-MLV逆转录酶(Takara, 中国大连)、模板总RNA 0.5 μg组成10 μL逆转录体系，反应条件为30℃、10 min；42℃、60 min；75℃、15 min，冰浴2 min。然后使用2.5 μl RT产物作模板在GeneAmp 2720热循环仪(美国加州应用生物系统公司)上PCR扩增H9c2和MARC-145细胞中CD151、CD163、Vimentin和Sn及PRRSV N蛋白基因片段，程序为94°C变性10 min；95°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸60 s，25个循环；72°C变性10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。本实验中使用的引物如表1所示。

表1 本研究中用于鉴定细胞受体和N基因转录本的引物

1.4 间接免疫荧光分析

H9c2和MARC-145细胞接种于玻片上，培养24 h后使用75%乙醇在4 °C固定30 min；然后用含1%牛血清白蛋白的PBS封闭1 h，PBS洗涤细胞；用相应一抗37°C孵育1 h，再用PBS洗涤细胞3次；荧光标记的二抗在37 °C孵育1 h。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole, DAPI; Sigma, MO, USA)室温下染色5min，LeicaDMI6000B荧光显微镜(德国莱卡)观察细胞中相关蛋白表达情况。

1.5 病毒吸附试验

为了解PRRSV是否能与H9c2细胞结合，H9c2、MARC-145细胞与3 MOI PRRSV SD16在4℃孵育1 h，用预冷的PBS洗涤细胞5次，反复冻融3次后通过MARC-145细胞滴定法测定与H9c2细胞吸附的感染性病毒数量TCID50。

1.6 PRRSV感染试验

将0.01 MOI PRRSVSD16接种于MARC-145和H9c2细胞，37℃孵育1 h后用预温的培养液轻轻冲洗细胞，然后改用含3%胎牛血清的DMEM继续培养。于病毒接种后24 h、48 h、72 h和96 h收集细胞培养上清液或细胞裂解细胞，用RT-PCR检测PRRSVN基因表达。检测N基因的引物根据Wang文献设计。

1.7 数据分析

使用GraphpadPRISM5.0程序进行统计分析。数据进行t检验以确定MARC-145和H9c2细胞中PRRSV SD16病毒滴度差异，组间统计学分析*表示P<0.05; **表示P<0.01; ***表示P<0.001。

2 结果与分析

2.1 H9c2细胞中受体的鉴定

本研究首先运用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测了这些分子在H9c2中的表达。RT-PCR在H9c2细胞中可检测到CD151和波形蛋白的转录本，但未检测到CD163和Sn的转录本(图1)。免疫荧光分析结果显示，CD151和波形蛋白在H9c2(图2A和图2D)细胞和MARC-145细胞(图2F和图2I)中均有表达，CD163仅在MARC-145细胞中表达(图2B)，两种细胞均不表达Sn蛋白(图2C和2H)。

图1 RT-PCR鉴定H9c2细胞受体

图2 间接免疫荧光检测在H9c2和MARC-145中细胞的PRRSV受体

2.2 PRRSV能够吸附H9c2细胞

PRRSV进入宿主细胞的第一步是吸附宿主细胞。2012年Feng等人研究表明PRRSV可与CD151结合，因此本研究首先验证了H9c2细胞是否能吸附PRRSV。4 ℃吸附试验结果显示H9c2和MARC-145细胞吸附PRRSV病毒量TCID50无显著差异(P>0.05)，表明H9c2细胞可以吸附PRRSV病毒(图3)。

图3 H9c2和MARC-145细胞的病毒吸附实验

2.3 PRRSV在H9c2细胞中复制

为了解病毒在H9c2细胞中的复制情况，将PRRSV SD16株以0.01MOI接种于H9c2和MARC-145细胞中，观察病毒在H9c2和MARC-145细胞中的复制情况。感染后不同时间收集细胞上清和细胞裂解液进行RT-PCR分析。与MARC-145细胞相比，H9c2细胞培养上清液和细胞裂解液中均未扩增出PRRSV N基因产物(图4A和图4B)。与RT-PCR结果一致，在整个感染过程中没有观察到CPE(数据未显示)，这一结果提示PRRSV没有在H9c2细胞中复制。

图4 PRRSV在H9c2和MARC-145细胞中的复制

3 讨论

本研究探讨了H9c2细胞作为PRRSV体外培养新细胞模型的可能性。虽然H9c2表达CD151和波形蛋白，但病毒只能与H9c2细胞结合，不能在H9c2细胞中复制。由于PRRSV是影响养猪场的主要病原体之一，迫切需要找到适宜的细胞模型来研究病毒的致病机理，并开发更有效的疫苗。许多研究已经证明PRRSV的细胞嗜性在一定程度上是由其细胞表面表达的一些蛋白质决定的，如唾液粘附素、CD163、CD151和波形蛋白已被证明在使非易感细胞中对PRRSV感染易感中发挥作用。然而，由于易感性的限制，PRRSV体外只能在猪肺泡巨噬细胞(PAM)和MA-104及其衍生细胞系(MARC-145和CL2621)中增殖培养。

本研究首次在H9c2细胞中鉴定了唾液粘附素(也称CD169)、CD163、CD151和波形蛋白的表达。H9c2细胞表达CD151和波形蛋白，但不表达CD163和Sn(图1和图2)。Provost等人发现的一种来源于猴肾细胞系SJPL，虽然其来源不是ST-Jude猪肺细胞，但它是PRRSV的易感细胞。该细胞系表达CD151，但不表达Sn和CD163，故CD151可能是PRRSV的结合蛋白。Hochdorfer等人证明CD151与人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)进入相关，我们检测表明H9c2和MARC-145对PRRSV的吸附能力相同(图3)。虽然靶细胞上病毒受体的存在是感染易感性的重要决定因素，但其他几个细胞因素可能在决定病毒复制方面也起着关键作用。

CD151在BHK-21细胞对PRRSV的易感性中起重要作用，另外两个新的易感细胞系SJPL和PEE细胞表达CD151。因此，我们想验证H9c2细胞是否支持PRRSV复制。虽然H9c2细胞表达CD151和波形蛋白，但接种病毒24、48、72和96 h后H9c2细胞培养上清液和细胞裂解液中均未检测到N基因表达(图4和图5)。未能从H9c2中恢复感染性病毒可能是由于某些未知因素缺失或异源CD151的氨基酸序列不同所致。虽然IFA和RT-PCR检测表明H9c2细胞表达CD151和波形蛋白，但PRRSV只能与其结合而不能进入细胞在其中复制。研究结果表明CD151和波形蛋白不是PRRSV病毒感染不可缺少的因子，可能还有其他分子参与PRRSV感染，H9c2不是适宜PRRSV感染的细胞模型，PRRSV感染细胞趋向性的主要机制仍有待进一步研究。