董亚茹,聂玉霞,李云芝,赵东晓,耿兵,王照红
(山东省蚕业研究所,山东 烟台 264002)
土壤盐渍化是自然界常见的逆境,全世界约有20%的耕地受到盐渍化威胁,严重影响了植物的生长、光合作用及生物量积累、产量等[1,2]。植物对非生物胁迫的反应受到多种因素的影响,涉及大量抗性基因的表达与调控,因此要提高植物对逆境的抗性就要从一些关键的调节转录因子着手。AP2/ERF类转录因子是植物特有的与胁迫应答有关的转录因子超家族。该类转录因子都具有1个或2个由60~70个氨基酸残基组成的非常保守的AP2/ERF结构域。Sakuma等[3]依据AP2/ERF转录因子的AP2结构域相似性将其划分为5大类,即AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist。不同植物中AP2/ERF转录因子及其各亚家族成员的数量存在差异。桑树中共鉴定到116个AP2/ERF转录因子家族成员,其中ERF 58个,AP233个,DREB 21个,RAV 3个,Soloist 1个[4]。
20世纪90年代,第一个AP2/ERF转录因子从拟南芥中分离出来,研究表明其参与调控了花的发育过程[5]。事实证明,AP2/ERF转录因子不仅参与调控植物的生长发育,在响应低温、干旱、高盐、缺氧、高温等逆境胁迫方面也起到非常重要的作用[6,7]。拟南芥中AtCBF3基因可以诱导编码脯氨酸合成关键酶的表达,增加体内游离脯氨酸含量,提高植株的耐寒性[8]。过表达AtERF1基因的转基因拟南芥植株同时表现出对高温、高盐及干旱的耐受性,形态学观察发现植株通过减小叶片气孔孔径以降低水分流失[9]。覃利萍[10]在对刚毛柽柳的研究中发现ThCRF1转录因子可以促进海藻糖和脯氨酸的生物合成以及提高SOD和POD活性,从而提高植物对盐胁迫的耐受性。Yao等[11]发现拟南芥ERF74和ERF75受缺氧胁迫诱导,通过调控缺氧响应基因的表达来提高植株的缺氧耐受能力,同时敲除ERF74和ERF75的突变体植株表现出对淹水胁迫较高的敏感性。高温胁迫下拟南芥AtCBF3显著表达,与野生型相比,转AtCBF3基因的马铃薯植株ROS积累量减少,光合作用显著提高,表现出更强的耐高温性[12]。此外,AP2/ERF类转录因子也参与乙烯的生物合成及信号传导。
本研究将MnERF2基因过表达载体(pROKⅡ-MnERF2)、抑制表达载体(pROKⅡ-MnERF2-SRDX)瞬时转入桑树中并通过NaCl胁迫使其表达,比较分析了不同转基因植株的耐盐生理指标,初步鉴定MnERF2的功能,以期为桑树及木本植物耐盐分子机制研究奠定理论基础。
供试桑树品种为杂交种桂桑优12,种子购于广西蚕业技术推广总站。试验于2021年3月在山东省蚕业研究所组培实验室进行。挑选饱满一致的种子,在超净台中用75%乙醇消毒1 min,然后用5%次氯酸钠消毒10 min,最后用无菌水冲洗5次,铺种到装有MS培养基的培养皿中。一周后挑选萌发无菌的种子移栽到装有MS培养基的组培瓶中,每瓶4颗种子,以此获得大量无菌桑树植株,用于瞬时侵染试验。植物过表达载体(pROKⅡ-MnERF2)、抑制表达载体(pROKⅡ-MnERF2-SRDX)由本实验室构建保存。MnERF2属于ERF亚家族,GenBank登录号为XM_010106513,由本实验室从桂桑优12中克隆获得。
选择生长一致的1个月左右的桑树无菌苗,将构建好的MnERF2基因过表达载体(pROKⅡ-MnERF2,OE)、抑 制 表 达 载 体(pROKⅡ-MnERF2-SRDX,RNAi)和空载体(pROKⅡ,WT)分别瞬时侵染桑树组培苗,侵染方法参照Ji等[13]的描述。桑树植株在1/2MS培养基中培养48 h后移至含有100 mmol·L-1NaCl的1/2MS培养基中,在胁迫处理0、6、12、24、48 h取整株桑树材料,经液氮速冻后保存于-80℃冰箱,用于后续试验。
用植物RNA试剂盒提取桑树植株总RNA,并反转录成cDNA。将反转录产物稀释10倍,选择MnRPL15和β-actin作为内参基因,引物见表1,由上海生工生物有限公司合成。RT-PCR反应体系为:TB Green PremixEx Taq10μL,基因特异性上下游引物各1μL(10μmol·L-1),模板2 μL,补ddH2O至20μL。每个测试样品进行3次重复试验。反应程序按照TB Green PremixEx Taq(TaKaRa No.RR820Q)说明进行,在CFX96 Real-Time PCR Detection System仪器(Bio-Rad Bio.CA.USA)上完成。RT-PCR数据利用2-△△Ct法[21]进行分析。
表1 RT-PCR引物及其序列
NaCl胁迫48 h后对MnERF2基因瞬时表达量进行RT-PCR分析,结果(图1)显示,MnERF2基因在瞬时过表达(OE)株系中的表达量最高,在抑制表达(RNAi)株系中最低。表明已成功获得了瞬时过表达和抑制表达MnERF2基因的桑树植株。
图1 MnERF2基因瞬时转化桑树植株qRT-PCR检测
2.2.1 ROS及MDA含量的变化 NaCl胁迫后,MnERF2基因OE株系中的、H2O2、·OH和MDA含量均低于野生株,而RNAi株系中的含量高于野生株,且随着处理时间的延长,各株系中的、H2O2、·OH和MDA含量均不断增加。胁迫48 h时,OE株系的、H2O2、·OH和MDA含量分别比野生株降低了17.67%、34.42%、30.24%和27.40%,而RNAi株系分别比野生株升高了27.45%、46.17%、21.74%和9.71%(图2)。
图2 NaCl胁迫不同时间转基因和野生桑树中ROS和MDA含量的变化
2.2.2 抗氧化酶活性 NaCl胁迫后,MnERF2基因OE株系中SOD、POD、CAT、GST活性均强于对照,RNAi株系中则均弱于对照,且随着处理时间的延长各株系中的四种保护酶活性均不断增加。胁迫48 h时,OE株系的SOD、POD、CAT、GST活性分别比野生株提高了36.05%、23.86%、37.98%、24.46%,RNAi株系的则比野生株降低了28.16%、29.32%、23.74%、22.24%(图3)。
图3 NaCl胁迫不同时间转基因和野生桑树中SOD、POD、CAT和GST活性的变化
2.2.3 渗透调节物质含量 NaCl胁迫后,MnERF2基因OE株系中AsA、GSH、脯氨酸含量均高于对照,而RNAi株系中均低于对照,随着处理时间的延长均不断增加。胁迫48 h时,OE株系的AsA、GSH、脯氨酸含量分别比野生株提高41.73%、22.47%、34.47%,RNAi株系则分别比野生株降低25.18%、18.32%、31.03%(图4)。
图4 NaCl胁迫不同时间转基因桑树和野生桑树中AsA、GSH和脯氨酸含量的变化
由于胁迫48 h的抗氧化酶活性最高,因此对该时间SOD、POD、CAT三种酶基因的表达量进行分析,结果(图5)显示,MnERF2基因的OE株系中三种酶基因的表达量均显著高于对照,而RNAi株系中三种酶基因的表达量均显著低于对照。
图5 NaCl胁迫48 h转基因和野生桑树中抗氧化酶基因的表达量
转录因子可以与启动子内的顺式元件相互作用,调节下游基因的转录,在植物抵抗非生物胁迫中具有重要作用[22]。因此,发掘抗非生物胁迫相关转录因子,研究其抗逆分子机制,能够为植物抗逆分子改良提供重要数据和材料。已有研究显示,不同植物的ERF转录因子通过调控胁迫响应基因,在高盐度、干旱和低温等非生物胁迫响应中发挥重要作用[23-26]。本研究前期在桑树盐胁迫转录组数据分析中发现ERF基因响应盐胁迫的诱导,并从中筛选到一个上调表达倍数较高的ERF基因,命名为MnERF2,推测其在桑树耐盐响应中发挥一定功能。
为了验证MnERF2基因的耐盐功能,分析桑树响应盐胁迫的生理生化变化,本研究分别构建植物过表达载体(pROKⅡ-MnERF2)及抑制表达载体(pROKⅡ-MnERF2-SRDX),通过农杆菌介导的高效瞬时遗传转化获得了MnERF2基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(RNAi)桑树植株,RT-PCR检测结果显示,MnERF2基因在OE植株中的表达量显著高于在RNAi植株中,表明获得了瞬时表达桑树植株,这与在拟南芥[21]、白桦[27]、柽柳[28]上的研究结果类似,可用于后续抗逆功能的研究。
活性氧(ROS)是有氧代谢的副产物[29]。当植物遭遇盐和干旱胁迫时,ROS会过度积累,导致DNA、脂类、蛋白质的损伤,最终导致氧化应激[30]。通过抗氧化系统清除ROS,可将ROS保持在较低的稳态水平[31]。盐胁迫可以显著影响植物细胞质膜脂质过氧化,从而改变质膜渗透性,调节离子的渗透模式,盐胁迫引起的这种膜损伤也与ROS的增加有关[32]。MDA是脂质过氧化作用的最终产物,其积累量反映了氧自由基引起的细胞膜损伤程度[13]。为此,本研究分别对NaCl胁迫条件下MnERF2基因过表达、抑制表达及野生桑树植株的ROS和MDA含量进行比较分析,结果显示,随着胁迫时间的延长,过表达MnERF2基因可以降低桑树在盐胁迫下的O2·-、H2O2、·OH和MDA含量,说明MnERF2基因可以降低盐胁迫下的氧化应激,从而保护细胞膜、减轻损伤,具有一定的耐盐性。
为了避免ROS过度积累造成的氧化损伤,植物自身抗氧化系统会通过提高抗氧化酶活性和非酶物质来清除ROS。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是一种多功能酶,在外源性物质的解毒和应激代谢中起着至关重要的作用,是植物在逆境条件下的重要因子,可防止氧化损伤[33]。拟南芥AtGSTU19在盐度和干旱条件下表达上调,柽柳ThGSTZ1基因在干旱和盐胁迫下表达上调[34,35]。本研究中,过表达MnERF2基因可以显著提高桑树在盐胁迫下的SOD、POD、CAT、GST活性,具有正向调控作用,从而增强ROS清除能力,进而提高桑树的耐盐性。这与前人[28,36]的研究结果类似。
抗坏血酸(AsA)具有抗氧化作用,能有效清除羟基自由基和过氧化物[37]。谷胱甘肽(GSH)是一种低分子量的硫醇,广泛分布在动植物中[38,39],可以直接去除活性氧,是一种重要的抗氧化剂[40]。同时,GSH作为GST的底物,具有活性氧清除作用[38]。游离脯氨酸(Pro)可以调节细胞膜的渗透性,在稳定膜和蛋白质等生物大分子结构方面发挥作用,起到对盐、干旱和污染物胁迫的抗性作用[41]。本研究中,过表达MnERF2基因可以使盐胁迫桑树中的AsA、GSH、脯氨酸含量显著高于对照和抑制表达植株。由此可见,MnERF2能够通过控制盐胁迫下AsA、GSH、脯氨酸的生物合成来增加植物的抗氧化物质含量,提高渗透势,最终提高植物的耐盐性。
综上所述,盐胁迫下过表达MnERF2基因可通过增强抗氧化酶SOD、POD、CAT、GST活性,增加抗氧化物质和渗透调节物质含量,增强ROS清除能力,减少细胞受损或死亡,从而提高桑树的耐盐能力。