一株细菌素产生菌的分离鉴定及其所产新型细菌素的结构特性研究

＊刘哲 王金泽 黄一刚 任婷 金文刚 裴金金

（陕西理工大学 生物科学与工程学院 陕西 723000）

食品行业非常需要能够防止腐败或致病细菌污染的试剂。然而，由于大多数消费者担心常用食品防腐剂的安全性，人们对天然和安全的防腐剂替代品的需求很高[1]。细菌素是一种对人体具有低口服毒性的低分子量多肽[2]，这些化合物作为生物防腐剂在食品工业中显示出良好的应用前景。根据Cotter，Hill，Ross[3]，细菌素分为两大类：I类，以羊毛硫氨酸为基础的细菌素；II类，非羊毛硫氨酸细菌素。II类细菌素分为4个亚类：IIa类、IIb类、IIc类和IId类[7]。虽然已经发现了大量细菌素，但除了少数I类和IIa类细菌素的作用机制外，它们发挥抗菌作用的相应机制尚不清楚。

康普茶作为中国南方的一种功能性饮料已有数千年的传统，最近，它因其多种功能特性而受到欢迎。从康普茶中分离到的乳杆菌主要有球状乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌，大多数研究都集中在康普茶的真菌区系上。在过去的几年里，研究人员将重点放在从康普茶中分离出的功能性乳酸菌。在这项研究中，从中国汉中市的传统康普茶中分离的植物乳杆菌#SLG10的无细胞上清液（CFS）中筛选并纯化了一种名为植物乳杆菌#SLG10的新型细菌素。随着证明该肽的分离，我们还阐明了其抗菌作用机制。

1.材料和方法

(1)产细菌素乳酸菌的筛选及鉴定

①乳酸菌的分离

康普茶购自陕西省汉中市。将1g康普茶发酵剂压碎并浸入10mL无菌蒸馏水中。琼脂培养基上进行培养（MRS，Solarbio，北京，中国），37℃下培养48h。根据Liu等人[4]的方法获得无细胞上清液（CFS）。使用琼脂孔扩散法定量CFS对金黄色葡萄球菌CICC10384和大肠杆菌CICC10302指示菌株的抗菌活性。如果在琼脂孔周围没有观察到抑制区，则将抑制记录为阴性。用抑菌活性（Log）和抑菌圈直径构建标准曲线。抗微生物活性表示为每毫升任意单位（AU），一个AU定义为显示明显生长抑制区的最高稀释度的倒数。

②细菌素产生菌菌株鉴定

用7F和1540R引物进行16SrRNA基因序列分析，鉴定菌株的基因型（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT,3′-AGGAGG TGATCCAGCCGCA）[6]。用Ezup柱状细菌基因组DNA纯化试剂盒提取植物乳杆菌#SLG10的DNA。PCR产物用SanPrep柱DNA凝胶提取试剂盒纯化。通过与NCBI数据库进行比较来执行序列的相似性搜索。

(2)细菌素的纯化

①生物色谱制备

根据Tang等人使用的方法的稍微修改版本进行生物色谱设置。用20%（v/v）盐酸活化二氧化硅8h，然后用去离子水洗涤至中性，在120℃下干燥。2g蛋黄磷脂酰胆碱（EYPC）和1g 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-gly-蜡油磷脂酰甘油（钠盐）（DMPG）（2:1，w/w）溶于CHCl3/CH3OH（2:1，v/v），与20g 活性二氧化硅混合，并在恒温（4℃）条件下混合120min，通过旋转蒸发仪除去溶剂，用N2吹扫干燥的残余物并真空干燥过夜。脂质膜包被的多孔硅胶在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中浸泡12h，在4℃下5000×g离心20min，然后用10mM、pH7.2的PBS缓冲液冲洗3次，作为250×4.6mm玻璃柱的填充物。

②细菌素的筛选纯化

色谱柱用PBS（10mm，pH7.2，50mM NaCl）洗脱，植物乳杆菌#SLG10的CFS在25℃下以PBS为流动相（0.5mL/min流速）洗脱，洗脱用分光光度法在215nm处监测重复20次。蛋白质含量用Bradford法测定。收集馏分并冷冻干燥，并筛选抗金黄色葡萄球菌CICC10384的抗菌活性，然后使用梯度洗脱对最有效的部分进行反相高效液相色谱（RP-HPLC）（Symmetry C18柱，250×4.6mm，5μm，Waters，Dublin，Ireland）。将B相（100%乙腈）与A相（0.05%（v/v）三氟乙酸（TFA））混合40min，使B相（100%乙腈）的含量从5%增加到100%，从而改变流动相的含量，A相的进样体积为1mL，流速为0.5mL/min，温度保持在恒定水平（25℃）。

(3)细菌素结构表征

分离的植物乳杆菌#SLG10的一级结构通过N-氨基酸分析仪确定，然后在NCBI数据库中进行同源性搜索。

(4)抗菌活性

细菌素对敏感细菌的最低抑菌浓度（MIC）根据临床和实验室标准研究所（CLSI）的程序[6]进行测定。

CICC：中国工业菌种收藏中心；

MIC：能抑制指示菌株生长的细菌素的最低浓度；

MBC：杀灭99.9%(下降三个数量级）的受试微生物所需的最低细菌素浓度。

2.结果与讨论

(1)细菌素产生菌的分离鉴定

从康普茶中分离出的7株菌株是潜在的LAB活性菌株。其中，菌株SLG10是唯一能够同时作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（金黄色葡萄球菌CICC10384和大肠杆菌CICC10302）的菌株。在排除了菌株SLG10抑菌效果与有机酸含量有关的可能性后，选择菌株SLG10作为细菌素产生菌。基于菌株 SLG10 16S rDNA序列的系统发育树推测菌株SLG10为植物乳杆菌。因此，我们将菌株SLG10命名为植物乳杆菌#SLG10。

过去几年，研究人员对康普茶的真菌成分非常关注。同时，康普茶也可以被认为是功能性乳酸菌的潜在丰富来源。如今，植物乳杆菌、益生菌菌株普遍被认为是安全的[8]。植物乳杆菌#SLG10作为一种植物乳杆菌，不仅可以用作产生细菌素的菌株，而且还具有作为发酵食品发酵剂的潜力。

(2)细菌素的纯化

生物色谱洗脱如图1A所示，仅获得一种洗脱液，抗菌活性试验表明该洗脱液为细菌素部分，结果表明生物色谱法对细菌素的鉴定具有良好的特异性。合并洗脱液并使用反相高效液相色谱法进一步分离，主峰如图1B所示，保留时间为21.3min。

图1 细菌素SLG10的纯化

在本研究中，生物色谱法能够从植物乳杆菌#SLG10的无细胞上清液（CFS）中快速筛选和分离细菌素。

(3)植物乳杆菌#SLG10的结构特性

质谱分析显示，一个与质量为1422Da的物种有关的特征峰。该化合物的一级结构为十肽，序列为ASN-IleVal-Trp-Gln-Leu-Ile-Gly-Leu-Pro-Ala-Gln-Ala（NIVWQLIGLPAQA）。BLAST分析表明，该序列与NCBI数据库中已知的细菌素序列不同，因此分离出的多肽是一种新的细菌素，命名为植物乳杆菌#SLG10。植物乳杆菌#SLG10属于Ⅱ类细菌素，因为它不含羊毛硫氨酸或YGNGVXC。

CD谱表明植物乳杆菌#SLG10呈现不规则的螺旋结构，预测的植物乳杆菌#SLG10的三个结构分区表明它呈现不规则的线性形成。植物乳杆菌#SLG10的理论质量是1422.26Da，这与MS测试的结果一致。

在结构上，植物乳杆菌#SLG10类似于其他具有无规卷曲但具有明确构象的小而疏水的细菌素，这些结构特征可能会增加细菌素在复杂环境中的稳定性。

(4)植物乳杆菌#SLG10的稳定性

在本研究中，植物乳杆菌#SLG10在加热处理后仍保持其抗菌活性，在37℃储存14天，甚至在4℃储存2个月后仍保持其抑制活性（图2B）。植物乳杆菌#SLG10在pH2.0-7.0范围内稳定，但在pH8.0及以上时活性下降（图2C）。这些结果表明植物乳杆菌#SLG10在食品加工过程中将保持显著的稳定性。有趣的是，植物乳杆菌#SLG10对胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感（图2A），缺乏敏感性可能归因于肽的小尺寸。

图2 酶、温度和pH对细菌素SLG10的影响

A：T1-脂肪酶；T2-a-淀粉酶；T3-蛋白酶K；T4-木瓜蛋白酶；T5-a-胰凝乳蛋白酶；T6-胰蛋白酶；T7-胃蛋白酶；T8-过氧化氢酶；B：T1-60℃；T2-80℃；T3-100℃；T4-37℃持续14天；T5-4℃持续两个月；C：T1-pH2；T2-pH3；T3-pH4；T4-pH5；T5-pH6；T6-pH7；T7-pH8；T8-pH9；T9-pH10。三个重复相同，因此没有标准偏差。

(5)抗菌活性

植物乳杆菌#SLG10的抗菌活性如表1所示，植物乳杆菌#SLG10对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，重要的是，植物乳杆菌#SLG10对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也有活性。这种活性可能是因为细菌素的作用方式与抗生素不同。值得注意的是，植物乳杆菌#SLG10也对革兰氏阴性菌大肠杆菌有活性，根据敏感细菌的不同，植物乳杆菌#SLG10的MIC值为16～32μg/mL（表1）。

表1 细菌素SLG10的抗菌活性

3.结论

综上所述，SLG10菌株经鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum），是从我国南方传统的康普茶中分离到的。采用生物层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）联用的方法，从SLG10菌株的CFS中分离纯化植物乳杆菌#SLG10。这种新的Ⅱ类细菌素对G+和G-细菌均有抗菌活性。本文发现的新型细菌素是一种很有前途的抗菌剂，在食品保鲜或制药工业中具有潜在的应用前景。