食管鳞状细胞癌中SFRP4 表达水平及临床意义

黄 滨 王丽萍 林宝泉

1.联勤保障部队第九〇〇医院麻醉科，福建福州 350025；2.联勤保障部队第九〇〇医院心胸外科，福建福州 350025

食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是我国食管癌的主要亚型，占90%以上，5 年生存率只有15%～25%[1-2]。探索新的潜在生物标志物可能有助于提高ESCC 的诊断和治疗。分泌型卷曲相关蛋白4（secreted frizzled-related protein 4，SFRP4）是分泌型卷曲相关蛋白家族的成员之一，通过调节Wnt 信号转导通路对细胞增殖、自我更新和凋亡起重要作用[3-4]。SFRP4 表达上升促进前列腺癌的侵袭能力，且增加肿瘤术后复发风险[5-6]。本研究探讨SFRP4在ESCC 细胞、血清及组织中的表达，并探讨其临床价值。

1 材料与方法

1.1 细胞系、标本

食管鳞状上皮细胞系HET-1A 购自南京凯基生物科技发展有限公司；所有ESCC 细胞系均购自中国科学院上海细胞库。选取2013 年3 月至2015 年4 月联勤保障部队第九〇〇医院（以下简称“我院”）病理科存档的160 例ESCC 及癌旁石蜡组织标本，采用免疫组织化学染色检测SFRP4 的表达。纳入标准：①病理明确为ESCC；②根治性食管癌切除手术；③临床病理资料完整，随访可靠；排除标准：①腺癌；②因出血、梗阻等急诊手术。收集2019 年6 月至2020 年10 月我院70 例ESCC 患者、70 例Barrett 食管患者和70 名健康体检者的清晨空腹血清。Barrett 食管由内镜及病理活检诊断。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥公司，兔抗人SFRP4 多克隆抗体购自英国NOVUS 公司。

1.3 研究方法

细胞培养：使用RPMI 1640 培养基在37℃、5%CO2条件下培养细胞株，待生长至70%～80%培养皿进行传代培养。

Western blot 实验检测各组细胞系中SFRP4 的表达。提取总蛋白，测定总蛋白浓度，电泳，转膜，封闭2 h，洗膜，一抗过夜孵育，洗膜，二抗孵育，ECL 化学发光法显影。GAPDH 作为内参。

免疫组织化学染色检测ESCC 及癌旁石蜡组织标本中SFRP4 的表达：切片、脱蜡、水化、修复抗原、一抗4℃过夜，加二抗，显色，复染，封片。SFRP4 阳性表达定位于细胞浆。根据染色强度和染色细胞百分比进行判定。染色强度：无染色=0 分，浅黄色=1 分，棕黄色=2 分，棕褐色=3 分；染色细胞百分比：阳性率为0%～10%=1 分，阳性率为11%～50%=2 分，阳性率为51%～75%=3 分，阳性率为＞75%为=4 分。最终评分=染色强度×染色细胞百分比，0～2 分为低表达，≥3 分为高表达。

酶联免疫吸附试验法检测血清中SFRP4 的表达量：清晨空腹采集静脉血5 ml。严格按照试剂盒流程进行操作。用酶标仪绘制吸光度曲线计算样本SFRP4水平。

电化学发光法检测癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）的表达量：收集清晨空腹静脉血5 ml，离心后提取血清，严格按照说明书进行操作。正常参考值范围：CEA＜5 ng/L，SCCA＜1.5 ng/ml。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，采用t 检验；计数资料采用例数和百分率表示，采用χ2检验。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。受试者操作特征曲线计算曲线下面积（area under curve，AUC），采用MedCalc 软件比较AUC 的差异。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC 细胞系中SFRP4 的表达

ESCC 细胞系的表达均高于食管鳞状上皮细胞系HET-1A（P ＜0.05）。见表1、图1。

表1 ESCC 细胞系中SFRP4 的表达（n=3，）

表1 ESCC 细胞系中SFRP4 的表达（n=3，）

注 与食管鳞状上皮细胞系HET-1A 比较，aP ＜0.05。ESCC：食管鳞状细胞癌；SFRP4：分泌型卷曲相关蛋白4

2.2 石蜡组织中SFRP4 的表达及与临床病理特征的关系

ESCC 石蜡组织标本中SFRP4 的阳性率为46.9%（75/160），高于癌旁正常组织的15.6%（25/160）（χ2=36.364，P ＜0.001），见图2。ESCC 组织中SFRP4 的阳性表达与病理分期有关（P ＜0.05），见表2。

表2 SFRP4 的表达与临床病理特征关系（例）

2.3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表达量比较

ESCC 患者血清中SFRP4、CEA 和SCCA 表达水平高于Barrett 食管和健康体检者（P ＜0.05）。见表3。

表3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表达量比较（）

表3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表达量比较（）

注 与Barrett 食管患者比较，aP ＜0.05；与健康体检者比较，bP ＜0.05。SFRP4：分泌型卷曲相关蛋白4；CEA：癌胚抗原；SCCA：鳞状细胞癌抗原；ESCC：食管鳞状细胞癌

2.4 血清中SFRP4、CEA、SCCA 及三者联合检测的诊断价值

血清SFRP4、CEA、SCCA 三项联合检测的曲线下面积均高于单独检测（Z=3.562、3.197、3.012，P ＜0.05）。见表4、图3。

表4 血清中SFRP4、CEA、SCCA 及三者联合检测的诊断价值

3 讨论

我国ESCC 患者初诊时往往处于中晚期，整体生存率仍不高[7-9]。探讨ESCC 的发病机制，对ESCC 的早期诊断、靶向治疗具有重要的临床应用价值。

Wnt 信号传导通路是指配体Wnt 蛋白和膜蛋白受体结合激活细胞内下游通道的过程，在调控多种人体生理活动中起重要作用，Wnt 信号传导通路失调是人类多种恶性肿瘤最常见的异常信号之一[10-11]。SFRP4基因位于7 号染色体短臂上，全长10.99 kb，由着丝粒-全端粒方向的反义链转录而成[12]。SFRP4 蛋白C端的网状蛋白样结构域与Wnt 配体具有亲和力，通过调节Wnt 信号转导通路参与机体的发育和内稳态功能[13-14]。近年来，SFRP4 在多种疾病（例如糖尿病、骨性关节炎等）发挥重要作用，并引起广大学者的极大关注[15-17]。

有研究表明SFRP4 在不同恶性肿瘤中的表达不尽相同。原发性肝癌患者血清SFRP4 水平显著高于非肝癌患者[18]。Busuttil 等[19]发现SFRP4 在胃癌组织中表达增高，与侵袭性呈正相关，可作为术后患者预后的标志物。胰腺癌组织中SFRP4 的表达水平高于癌旁正常组织，是判断胰腺癌不良预后的独立危险因素[20]。然而，在子宫内膜癌中SFRP4 表达下调，并与远处转移、术后复发有关[21]。SFRP4 在ESCC 中的表达尚未报道，本研究判断SFRP4 与ESCC 间的关系。

ESCC 的早期诊断对患者的预后具有重要意义。血清肿瘤标志物具有方便、经济的特点，可用于早期诊断和判断复发的作用[22]。CEA 是一种广谱肿瘤标志物，在ESCC、重度吸烟和肝病中均可升高[23-24]。SCCA 可用于判断中晚期鳞状细胞癌的预后，但CEA 和SCCA诊断ESCC 的灵敏度和特异度均较差[25-26]。本研究中，SFRP4、CEA、SCCA 三者联合检测的曲线下面积均高于单独检测，提示三者联合监测有利于ESCC 的诊断。本研究中，所有ESCC 细胞系中SFRP4 表达量均高于食管鳞状上皮细胞系，ESCC 患者血清SFRP4 表达量高于Barrett 食管和健康体检者，ESCC 石蜡组织标本的SFRP4 阳性率高于癌旁正常组织，显示SFRP4与ESCC 的发生有关。ESCC 石蜡组织SFRP4 的表达与病理分期有关，提示SFRP4 促进食管的发展和迁移。

总之，SFRP4 与CEA、SCCA 联合检测有利于提高ESCC 诊断的准确性，参与ESCC 的发生、发展，可作为靶向治疗的重要分子标志物。