吴思蒙 王利刚 张雪燕 王太升 张继红∗
1.北华大学医学院,吉林 吉林 132000;2.中国昆仑工程有限公司吉林分公司,吉林 吉林 132010
2012年美国环保局(US EPA)和国际癌症研究机构将(trichloroethylene,TCE)列为1类致癌物[1]。尽管研究人员对TCE毒性做了大量研究,但TCE导致肝脏纤维化程度及发病机制尚不明确。本文研究了吸入三氯乙烯后小鼠肝脏产生不同程度纤维化,以及I型胶原(Collagen I)、α-平滑肌肌动蛋白(α- SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)在小鼠肝组织中的表达水平。
1.1 主要试剂与仪器 TCE为分析纯(美国Sigma公司);Collagen I、α-SMA、CTGF(武汉三鹰生物技术有限公司);显微镜(Olympus公司);SYD-B病理石蜡包埋机(沈阳誉德电子仪器有限公司);RM2245轮转式切片机(徕卡显微系统有限公司);ZPJ-1展片机(天津天利航空机电有限公司);GZX-9070MBE干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);LEICA ASP300S全自动组织脱水机;CV5030多功能染色玻璃封片机。
1.2 实验动物 选择健康清洁级雄性小鼠45只(购于长春亿斯实验动物技术有限公司),体重16~18g,小鼠被饲养在干净的动物房里,并保持12小时光照/黑暗的昼夜节律,饲养条件为温度22~26℃,相对湿度45~65%。
1.3 动物染毒与分组 自由进食,适应性饲养1周后随机分为三组,包括清洁空气对照组(5只)、低浓度三氯乙烯组1500mg(20只)、高浓度三氯乙烯组5500mg(20只)。采用静式吸入染毒法,染毒时用胶带将染毒柜密封,试验时将染毒物质迅速注入染毒柜内有加热功能的装置中,打开风扇使柜内空气分布均匀。将小鼠暴露于不同浓度的三氯乙烯气体中,每天染毒2小时,染毒结束后分别在实验2个月、3个月时,各处死10只小白鼠并在无菌条件下取出肝脏。
1.4 观察指标
1.4.1 组织病理观察:HE染色,网状纤维染色。
1.4.2 免疫组化检测 采用Envision法(多聚体两步法)免疫组化检测肝脏组织中α-SMA、Collagen I、CTGF蛋白的表达。
1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,用image-pro plus软件测得平均光密度值,用±s表示,组内比较选用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P<0.05则表示具有统计学意义。
2.1 各组小鼠肝组织病理学观察结果
2.1.1 HE染色结果显示 清洁空气对照组肝小叶结构清晰,肝细胞大小正常,细胞核呈圆形,胞质丰富,并以中央静脉为圆心,肝细胞呈放射状排列,肝索排列规则。相同浓度的染毒组两个月时肝细胞结构基本正常,肝细胞肿胀变性,汇管区结构清晰,小叶间纤维结缔轻度增生;三个月时肝细胞变性加重,可见肝细胞坏死,小叶间可见成纤维样细胞,汇管区和小叶间纤维结缔组织增生,肝索排列紊乱,少量炎细胞浸润。染毒时间相同,高浓度组比低浓度组肝细胞变性和纤维结缔组织增生明显。
2.1.2 Masson染色结果显示 清洁空气对照组肝组织无明显胶原纤维增生。相同浓度的染毒组两个月时有少量蓝色胶原纤维增生,三个月时蓝色胶原纤维增多。染毒时间相同时,高剂量组比低剂量组蓝色胶原纤维增多明显。
2.1.3 网状纤维染色结果显示 对照组网状纤维呈絮网状均匀分布于肝组织中,未见网状纤维增粗、融合。各染毒组肝组织内网状纤维失去正常分布状态,汇管区周围网状纤维均有不同程度增粗。
2.2 免疫组化染色结果
2.2.1 各组α- SMA表达水平
染毒组α-SMA蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05);吸入TCE浓度相同时,染毒三个月α-SMA蛋白表达水平高于染毒两个月 (P<0.05);吸入TCE时间相同时,高浓度染毒组α-SMA蛋白表达水平高于低浓度染毒 (P<0.05),见表1。
表1 各组小鼠肝组织α-SMA蛋白的表达(±s n=10)
表1 各组小鼠肝组织α-SMA蛋白的表达(±s n=10)
注:与(A)比较∗P<0.05;与(B)比较#P<0.05;与(C)比较※P<0.05;与(D)比较◎P<0.05
组别α-SMA IOD值(积分光密度值)清洁空气对照组(A) 0.022±0.010 2个月低浓度染毒组(B) 0.266±0.033∗2个月高浓度染毒组(C) 0.475±0.056∗#3个月低浓度染毒组(D) 0.763±0.031∗#3个月高浓度染毒组(E) 0.918±0.333∗※◎
2.2.2 各组Collagen I表达水平 染毒组Collagen I蛋白表达水平明显高于对照组 (P<0.05);吸入TCE浓度相同时,染毒三个月Collagen I蛋白表达水平高于染毒两个月 (P<0.05);吸入TCE时间相同时,高浓度染毒组Collagen I蛋白表达水平高于低浓度染毒 (P<0.05),见表2。
表2 各组肝组织Collagen I蛋白的表达(±s n=10)
表2 各组肝组织Collagen I蛋白的表达(±s n=10)
注:与(A)比较∗P<0.05;与(B)比较#P<0.05;与(C)比较※P<0.05;与(D)比较◎P<0.05
0.014±0.004 2个月低浓度染毒组(B) 0.030±0.005∗2个月高浓度染毒组(C) 0.053±0.006∗#3个月低浓度染毒组(D) 0.090±0.008∗#3个月高浓度染毒组(E) 0.110±0.006∗※◎组别Collagen IIOD值(积分光密度值)清洁空气对照组(A)
2.2.3 各组CTGF表达水平 染毒组CTGF蛋白表达水平明显高于对照组 (P<0.05);吸入TCE浓度相同时,染毒三个月CTGF蛋白表达水平高于染毒两个月(P<0.05);吸入TCE时间相同时,高浓度染毒组CTGF蛋白表达水平高于低浓度染毒 (P<0.05),及表3。
表3 各组肝组织CTGF蛋白的表达(±s n=10)
表3 各组肝组织CTGF蛋白的表达(±s n=10)
注:与(A)比较∗P<0.05;与(B)比较#P<0.05;与(C)比较※P<0.05;与(D)比较◎P<0.05
0.017±0.004 2个月低浓度染毒组(B) 0.036±0.006∗2个月高浓度染毒组(C) 0.058±0.005∗#3个月低浓度染毒组(D) 0.080±0.007∗#3个月高浓度染毒组(E) 0.108±0.007∗※◎组别CTGFIOD值(积分光密度值)清洁空气对照组(A)
TCE被列为I类致癌物,其职业暴露途径主要为经呼吸道和皮肤直接接触,严重威胁职业性接触TCE工人的健康。第一次由TCE引起病损的病例在1915年被报道,主要损伤部位在肝脏[3],纤维化是其中之一。
HE染色常用来显示组织或细胞一般形态的改变,也是观察肝纤维化情况常用的染色方法之一;Masson和网状纤维染色则是显示纤维结缔组织的重要染色方法,其能较为准确地判断出组织纤维化的严重程度[4]。
α-SMA是活化的成纤维细胞的标志,参与合成Ⅰ型胶原、Ⅲ 型胶原、纤维连接蛋白等多种细胞外基质成分,被认为是肝星状细胞激活的标志性蛋白并与肝纤维化有高度的相关性。
Collagen I是诱导细胞外基质的主要成分,其含量的高低在一定程度上反应了肝纤维化严重程度。抑制肝星状细胞的增殖,减少Collagen I的产生可以减轻甚至逆转肝纤维化[5]。
CTGF在机体创伤修复及器官纤维化疾病的发生发展中起到中心调节作用,是器官纤维化疾病缓慢进展的重要细胞因子,被认为是纤维化疾病的“总开关”。肝星状细胞的激活及表型改变被认为是肝纤维化进展中细胞外基质的主要来源,CTGF信使RNA水平显著增加,CTGF可能是刺激肝星状细胞活化增殖的关键因子之一。
本研究通过Masson和网状纤维染色印证了肝纤维化的存在,吸入TCE可致小鼠肝纤维化,且随着时间延长、剂量增加纤维化程度越重。TCE所导致肝纤维化时肝组织α-SMA、Collagen I表达明显增强,CTGF信号传导通路功能明显增强,对肝纤维化发生发展起到了正反馈效果。作为慢性疾病的早期阶段,早期纤维化阶段被普遍认为具有可逆性,并非不可逆的“疤痕组织”。因此,阻断早期肝纤维化进程可以成为治疗慢性肝疾病新的切入点,使慢性肝病在早期阶段就有治愈的可能性。研究发现,通过抑制CTGF表达能阻断TGF-β1/Smads通路,进而阻断肝纤维化的发生发展。目前肝纤维化治疗中已经有CTGF靶向疫苗能够抑制小鼠肝纤维化发展,未来CTGF可能成为抗肝纤维化治疗的重要靶点。由于本次实验持续时间较短,小鼠数量较少,可能导致实验结果有些许偏差,接下来会对现有实验进行优化进而深入研究为临床诊治工作提供更精准的依据。