HBV前基因组RNA水平与慢性乙型肝炎患者停药后复发风险的相关性

陈靖赜 祁玮 胡明乐 李华东 王静

研究显示，抗病毒治疗后，慢性乙型肝炎患者HBV DNA与HBV RNA均出现下降，且相较于HBV RNA，HBV DNA下降更快，HBV RNA逐渐升高并最终成为主要的病毒成分[1]。HBV RNA病毒颗粒所包含的核酸HBV前基因组RNA水平(pgRNA)在HBV复制过程中起着至关重要的作用，可反转录形成负链DNA，成为cccDNA与HBV DNA之间的桥梁，即rcDNA的模板，而抗病毒药物不能直接作用于cccDNA转录过程，故肝细胞核中仍存在无法清除的HBV cccDNA，增加停药后复发的风险[2]。本研究探讨HBV pgRNA水平与慢性乙型肝炎患者停药后复发风险的相关性，旨在为预防慢性乙型肝炎患者停药后复发提供理论依据。

资料与方法

一、病例来源及纳入排除标准

选取2017年5月至2019年5月武汉市金银潭医院已接受治疗且符合停药标准的224例慢性乙型肝炎患者为研究对象。纳入标准：①符合慢性乙型肝炎诊断标准[3]均接受规范化治疗；②符合停药标准[4]，HBeAg阳性者HBV DNA低于检测下限、ALT复常、HBeAg血清学转换，至少持续1年以上无异常；HBeAg阴性者HBV DNA水平低于检测下限，巩固治疗至少一年半，总疗程不少于2年半；③无肝硬化证据。排除标准：①合并其他病毒感染或伴有自身免疫性肝病；②接受过肝移植或计划肝移植者；③合并免疫缺陷疾病或癌症。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

二、方法

1. 一般资料收集：患者人口学资料包括年龄、病程、性别、HBV感染家族史、饮酒史、HBV基因型、体重指数等。

2. HBV血清学标志物检测：采用微粒子酶免疫分析技术及HBV诊断试剂盒[ABBOTT(雅培)公司]对停药时HBsAg、抗-HBe、HBeAg进行检测，记录HBeAg消失时间、HBeAg血清学转换时间、停药时有无抗-HBe。

3. HBV DNA 定量分析：采用实时荧光定量PCR法，经荧光定量核酸分析仪(Roche Light Cycler)及HBV核酸扩增荧光检测试剂盒(深圳匹基生物工程有限公司)对HBV DNA 定量分析。

4. HBVpgRNA水平检测：从HepG 2.2.15细胞上清液中提取总HBV RNA，采用赛默费希尔科学公司生产的HBV反转录引物第一链DNA合成试剂盒，将样品反转录成cDNA。PCR扩增中使用HBV pgRNA的上游和下游特异性引物。常规PCR扩增后，用北京天根公司生产的通用纯化和回收试剂盒纯化PCR产物，然后与质粒连接(北京转基因生物技术公司)。将其转化到Trans1-T1感受态细胞中，挑选阳性菌落后经PCR再次筛选。采用北京天根公司生产的TIANprep微型质粒试剂盒对阳性质粒分离并测序，同时采用该公司生产的稀释缓冲液以1 × 10连续稀释质粒，以10倍稀释制备标准品(1×1010份数/mL)；最后采用荧光定量PCR仪检测血清pgRNA水平。

5. 血清实验室指标检测：采用生化分析仪(Beckman CX7)和原装试剂对血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)进行检测。

三、随访

停药后前3个月内每个月随访1次，后每3个月随访1次，随访2年，每次随访观察肝功能、血清HBV病毒学标志物等。截止时间2021年5月1日，以停药后复发为随访终点。复发标准：获得病毒学应答的患者停药后，间隔1个月2次检测HBV DNA均>2×103IU/mL。

四、统计学方法

结 果

一、随访结果

截至2021年5月1日，共6例因各种原因失访，最终纳入218例，其中70例(32.11%)出现复发。

二、两组患者一般资料对比

两组患者年龄、病程、性别、HBV感染家族史、合并症、Child-Pugh分级、饮酒史、HBV基因型、体重指数对比差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

三、实验室指标对比

两组患者AST、HBeAg消失时间、HBeAg血清学转换时间、炎症活动度、HBeAg对比差异无统计学意义(P>0.05)，ALT、HBV DNA、停药时HBsAg、停药时有无抗-HBe、HBVpgRNA水平对比差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

四、慢性乙型肝炎患者停药复发风险的Cox回归分析

将停药复发情况作为因变量(1=复发，0=未复发)，Cox回归分析显示，HBVpgRNA水平、ALT、停药时HBsAg水平、HBV DNA为慢性乙型肝炎患者停药复发危险因素(均P<0.05)，见表3。

表1 两组患者一般资料比较

表2 两组患者实验室指标比较

表3 慢性乙型肝炎患者停药复发风险Cox 回归分析

五、HBVpgRNA水平与慢性乙型肝炎患者停药复发风险的相关性

限制性立方条图显示，HBVpgRNA水平与慢性乙型肝炎患者停药复发风险呈显著非线性关系(χ2=24.710 ，P<0.01)。见图1。

图1 HBVpgRNA水平与慢性乙型肝炎患者停药复发风险间的限制性立方条图

讨 论

即使按照现行的慢性乙型肝炎管理共识或指南建议的标准停药，慢性乙型肝炎患者停药后的复发率仍高达20%～50%[5,6]。Chang等[7]对77例慢性乙型肝炎患者使用核苷酸IDE类似物后随访发现，32.5%停药后复发。Kuo等[8]的研究中招募了122例接受恩替卡韦或TDF治疗的HBeAg阴性患者，结果显示，53例患者3年累积病毒学复发率为46.6%；累积复发率为32.11%，低于该研究，可能与随访时间长短有关，但仍提示应重视慢性乙型肝炎患者停药后复发情况，并密切随访。慢性乙型肝炎的根治需要清除被HBV感染肝细胞中的cccDNA，但即使在成功清除血清 HBV DNA 和HBsAg 数年后，肝内仍可能有低水平的cccDNA存在，提示仍无法彻底清除细胞内cccDNA[9]。HBV pgRNA以病毒颗粒形式表达于相关性肝病患者的血清中。研究显示，pgRNA在HBV DNA阴转后较长时间内仍可测，且理论上pgRNA是反转录产生rcDNA所必须的模板[10]。而慢性乙型肝炎药物治疗的关键是阻断反转录过程而发挥作用，因此，只要pgRNA仍然存在，停药后rcDNA便可再次被反转录，血清中可再次测得HBV DNA，即复发。相反，若pgRNA被完全清除，此时rcDNA也随之失去反转录模板，血清中HBV DNA水平也不会再次出现升高，故pgRNA水平与慢性乙型肝炎患者停药后复发风险间的关系得到关注。

Manolakopoulos等[11]研究显示，基线 ALT 每升高1倍正常值上限，复发风险则增加1.03倍(95%CI：0.96～ 1.10)。本研究中ALT为慢性乙型肝炎患者停药复发的危险因素，但危险因素HR值接近1，提示ALT作为慢性乙型肝炎患者停药复发的危险因素仍需进一步讨论，出现这种情况的原因可能与研究对象在治疗前均予以护肝降酶治疗，对血清ALT水平造成不同程度的影响有关。另外，本研究发现，两组停药时有无抗-HBe具有差异，Cox回归分析中抗-HBe无显著差异，说明停药时有无抗-HBe与复发无关。一项长期随访研究也显示，停药24周时的血清抗-HBe是否存在与复发无关，这可能是因为抗-HBe并非保护性抗体[12]。

治疗结束时(停药时)HBsAg水平可以预测长期随访中的HBsAg清除，获得HBsAg清除者的复发率明显降低。一项对HBeAg阳性患者干扰素治疗的研究显示，在78周时血清 HBsAg<1000 IU/mL者更有可能在长期随访中获得持续应答及HBsAg清除[13]。一项研究显示，治疗结束24周血清HBsAg 350 IU/mL是在近期应答者中有效识别低复发风险的临界值[14]。Luo等[15]研究中揭示了HBV DNA可预测停药后复发率。一项10年的队列研究显示，HBV DNA阴性(HR1.246，P=0.010)可用于病毒学复发潜在预测[16]。本研究显示，停药时HBsAg水平、HBV DNA为慢性乙型肝炎患者停药复发危险因素，与上述研究相符。

虽然HBV一直以来被定义为有包膜的不完整双链DNA病毒，但早期研究已在慢性HBV感染者血清中检测到HBV RNA的存在，且研究证实这些血清HBV RNA实质就是核衣壳内未经反转录的pgRNA[17]，与rcDNA一样，这些pgRNA以类病毒颗粒的形式存在于成熟病毒颗粒的核衣壳内，这一发现是对HBV经典复制过程的重要补充。Furutani等[18]研究显示，IFNα可通过提高pgRNA的m6A RNA修饰水平，降低pgRNA的稳定性，从而抑制HBV相关肝癌的发生。有研究证实，血清pgRNA可作为长期NAs治疗且血清HBV DNA检测不到的肝癌患者预后和复发的潜在预测因子[19]。Lin等[20]研究显示，在17.57%病例中，即使HBV DNA水平低于20 IU/mL，也能检测到HBV pgRNA，这也间接说明了血清HBV pgRNA水平可为停药后复发风险提供参考。Luo等[21]的研究揭示了NA治疗后的HBV pgRNA状态可以预测慢性HBV患者的长期预后，在治疗48周后保持HBVpgRNA阳性的患者具有增加的风险(95%CI：34.80～61.20)。本研究中，HBV pgRNA水平(HR=1.235，95%CI：1.064～1.432)为慢性乙型肝炎患者停药复发危险因素，且限制性立方条图显示，HBV pgRNA水平与慢性乙型肝炎患者停药复发风险呈显著非线性关系，其可能HBV pgRNA 的唯一来源仅为 HBV cccDNA，可作为 HBV cccDNA 转录产物，替代反映肝细胞内 HBV cccDNA 水平及 HBV 活跃程度，故对慢性乙型肝炎患者停药复发风险具有较高的预测价值。

综上所述，HBV pgRNA水平与慢性乙型肝炎患者停药后复发风险相关，可作为慢性乙型肝炎患者停药后复发风险的参考依据。由于各种客观原因的条件限制，未追踪患者停药后复发风险各实验室指标和HBV pgRNA水平的进展过程，未能进一步分析停药后HBV pgRNA水平的变化情况；其次，样本量相对较少，仍需更详细的研究来阐明HBV pgRNA水平与慢性乙型肝炎患者停药后复发风险间的关系。