柑橘提取物对仔猪盲肠微生物数量和代谢产物的影响

崔艺燕 鲁慧杰 李贞明 田志梅 余 苗 邓 盾 马现永,2*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心，广州 510640; 2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名 525000)

抗生素可通过调节肠道健康、增强营养物质吸收、平衡微生物菌群来缓解仔猪断奶应激[1]。然而抗生素的禁用/限用不利于仔猪断奶应激的缓解，对养猪业的发展产生负面影响。植物提取物能抑制有害细菌的生长，可提高动物的生长性能，是一种缓解仔猪断奶应激的抗生素替代品。柑橘提取物(citrus extract，CE)主要生物活性成分是黄酮类物质，具有抗炎、抗氧化、抗菌等功能[2-3]，是一种潜在的饲料添加剂。以往研究证明了CE在动物生产的益处。CE增强肉鸡的肠黏膜健康和刺激免疫反应[4]，改善肉鸡品质[5]，减少盲肠中大肠杆菌的数量[6]。CE可以调节和提高仔猪的免疫功能和抗氧化能力，提高蛋白质的吸收和利用，改善仔猪肠道健康[7-9]。

断奶影响仔猪能量代谢、蛋白质代谢以及肠上皮细胞的增殖[10]，会造成采食减少、胃肠道功能紊乱、腹泻等应激反应。断奶仔猪肠道不成熟，较多未消化的蛋白质会导致肠腔更多的蛋白质代谢产物产生，同时也更容易受到蛋白质代谢产物的负面影响。微生物发酵蛋白质会产生氨、生物胺、吲哚和粪臭素等物质，这些代谢物对肠上皮细胞有毒性和促炎作用，会破坏肠道屏障功能，损害动物健康[11-12]。肠道微生物及其代谢物对于维持肠道健康很重要[13]。然而，CE对断奶仔猪肠道微生物及其代谢物的影响研究有限。饲粮中添加CE是否会影响仔猪的盲肠蛋白质代谢产物仍不清楚。因此，本试验拟探讨饲粮添加CE对仔猪盲肠微生物数量及代谢产物的影响，为应用CE缓解仔猪断奶应激提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

15%金霉素购自广东某饲料科技有限公司。CE含有3.04%维生素C、2.38%维生素E、2.89%柠檬酸和20.77%总黄酮，由广东某科技发展有限公司提供。

1.2 试验动物、试验处理和试验饲粮

选用144头28日龄杜×长×大仔猪[体重(8.39±1.06)kg]，按体重随机分为3组，每组6个重复，每个重复8头猪(公母各占1/2)。试验周期为28 d。对照组(CON组)饲喂基础饲粮，抗生素组(ANTI组)在基础饲粮中添加75 g/t金霉素，CE组在基础饲粮中添加300 mL/t CE。基础饲粮组成及营养水平见本课题组同期文献[7-9]。本课题组同期试验表明，在数值上，CE组和ANTI组仔猪的生长性能优于CON组[9]。

1.3 饲养管理与屠宰采样

试验在广东省新兴县丰利田农业发展有限公司猪场进行。按照猪场常规程序管理。每个重复选取接近平均体重的2头仔猪，屠宰后分离出盲肠，将盲肠内容物混匀，收集约10 g内容物，-80 ℃保存。

1.4 微生物数量的计数

采用平板计数法10倍梯度稀释进行微生物数量的测定，大肠杆菌采用结晶紫中性红胆盐琼脂培养基，乳酸菌采用MRS琼脂培养基。

1.5 游离氨基酸含量的测定

参考文献[9]的方法，游离氨基酸的含量通过全自动氨基酸仪(HITACHI L-8900)测定。

1.6 酚和吲哚类化合物、生物胺含量的测定

参照文献[14]的方法，酚和吲哚类化合物、生物胺的含量使用高效液相色谱仪(Waters Alliance e2695)测定。

1.7 数据处理

用Excel 2010整理数据，用SPSS 25.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，后用Duncan氏法进行多重比较。结果用平均值和均值标准误(SEM)表示，P<0.05为差异显著，0.05≤P<0.10为有趋势。

2 结 果

2.1 CE对仔猪盲肠微生物数量的影响

由表1可知，与CON组相比，CE组盲肠乳酸菌数量显著增加(P<0.05)，ANTI组乳酸菌数量显著减少(P<0.05)。CE组盲肠乳酸菌数量显著高于ANTI组(P<0.05)。与CON组相比，CE组和ANTI组盲肠大肠杆菌数量显著减少(P<0.05)。CE组盲肠大肠杆菌数量显著低于ANTI组(P<0.05)。

表1 CE对仔猪盲肠微生物数量的影响(湿重基础)

2.2 CE对仔猪盲肠内容物游离氨基酸含量的影响

由表2可知，与CON组和ANTI组相比，CE组盲肠内容物中牛磺酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸的含量显著减少(P<0.05)；CON组与ANTI组间上述游离氨基酸含量无显著差异(P>0.05)。与CON组相比，CE组和ANTI组盲肠内容物中鸟氨酸和脯氨酸含量显著减少(P<0.05)。与CON组相比，CE组盲肠内容物中天冬氨酸、异亮氨酸、胱硫醚、羟赖氨酸、总氨基酸含量显著减少(P<0.05)，而谷氨酸和丙氨酸含量有减少的趋势(0.05≤P<0.10)；ANTI组上述氨基酸与CON组和CE组差异不显著(P>0.05)。3组间盲肠内容物中甘氨酸、瓜氨酸、α-氨基正丁酸、酪氨酸、苯丙氨酸、γ-氨基丁酸、色氨酸含量无显著差异(P>0.05)。

表2 CE对仔猪盲肠内容物中游离氨基酸含量的影响(湿重基础)

2.3 CE对仔猪盲肠内容物酚和吲哚类化合物、生物胺含量的影响

由表3可知，与CON组相比，CE组盲肠内容物中苯酚和粪臭素含量显著减少(P<0.05)；ANTI组盲肠内容物中苯酚和粪臭素含量与CON组和CE组差异不显著(P>0.05)。与CON组和ANTI组相比，CE组盲肠内容物中腐胺含量显著减少(P<0.05)，酪胺和精胺含量有减少的趋势(0.05≤P<0.10)。与CON组相比，CE组和ANTI组盲肠内容物中甲胺含量显著减少(P<0.05)。不同组间仔猪盲肠内容物中对甲酚、吲哚、色胺、尸胺、亚精胺、组胺、总生物胺含量无显著差异(P>0.05)。

表3 CE对仔猪盲肠内容物中酚和吲哚类化合物、生物胺含量的影响(湿重基础)

3 讨 论

3.1 CE对仔猪盲肠微生物数量的影响

断奶时仔猪微生物群落的变化表现为专性厌氧菌的减少和兼性厌氧菌数量的增加，这导致肠道内微生物多样性减少[15]。植物提取物可以通过减少肠道中的病原体来促进动物健康。在本研究中，与CON组和ANTI组相比，CE组增加了盲肠内容物中乳酸菌数量，同时减少了大肠杆菌数量，与以往研究结果[16-18]一致。柑橘果皮显著减少肉鸡盲肠的肠杆菌科和大肠杆菌的数量，显著增加乳酸菌数量[16]。Duque等[17]使用肠道微生态系统模拟器评估橙汁对肠道微生物群的影响，发现橙汁增加结肠乳杆菌数量和减少肠杆菌数量。Estruel-Amades等[18]发现200 mg/kg橙皮苷增加大鼠粪便乳杆菌数量并减少大肠杆菌数量。每天饮用橙汁可以增加女性粪便双歧杆菌和乳酸菌的数量[19]。乳酸菌数量较高表明CE对肠道平衡产生有益影响，乳酸菌抑制了大肠杆菌生长，减少大肠杆菌数量。乳酸菌影响潜在病原微生物的定植并优化免疫反应[20]。这与课题组以往研究结果一致，CE提高肠道细胞因子和分泌型免疫球蛋白A(sIgA)分泌，改善了仔猪肠道免疫[7]。与CON组相比，ANTI组减少大肠杆菌数量的同时显著减少了乳酸菌的数量。这与以往研究结果一致，ANTI对肠道微生物有损害作用，可能减少有益微生物的数量[21]。CE对微生物的积极作用可能与CE的活性成分(黄酮、维生素、有机酸)有关，这些化合物显示出抗菌和抗炎活性[22]。可见，CE对肠道微生态的效果优于ANTI。CE具有抑制有害肠道菌群和改善断奶仔猪肠道微生态系统的潜力，能够促进肠道健康，提高生产性能[9]。

3.2 CE对仔猪盲肠内容物游离氨基酸含量的影响

肠道中的游离氨基酸来源于膳食蛋白质和内源性蛋白质的水解以及微生物的合成代谢。微生物与宿主氨基酸代谢的相互作用影响机体全身代谢。抗生素能减少动物粪便中的丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸的含量[23-24]。本试验中ANTI组减少盲肠内容物中鸟氨酸和脯氨酸含量，即ANTI能够减少内容物中游离氨基酸的含量，与上述研究结果相似。饲粮添加CE减少了仔猪盲肠内容物中游离氨基酸含量，与Zeng等[25]研究结果一致。Zeng等[25]报道，CE减少高脂小鼠粪便中亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸的含量。CE和ANTI不同程度地减少了盲肠内容物游离氨基酸含量，与以前的研究结果[9]一致(肠胰蛋白酶活力提高)，即二者能提高蛋白质(氨基酸)消化吸收，减少到达盲肠的蛋白质(氨基酸)含量。

CE组仔猪血浆苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量的增加伴随着盲肠内容物中苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量的减少[9]，虽然本试验未检测空肠和回肠内容物中的游离氨基酸含量，但可以推测，小肠内容物游离氨基酸含量被吸收(减少)，到达盲肠的游离氨基酸必然减少，这可侧面表明CE可能增加氨基酸的可利用性。另外，短链脂肪酸主要由丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸和丝氨酸、蛋氨酸发酵合成[26]。试验中CE组的盲肠内容物中苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸含量减少，可能是因为这部分氨基酸被微生物用于合成乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸。另外，CE可能增加了盲肠微生物的蛋白质水解和脱羧酶活性[27]，促进短链脂肪酸和生物胺合成，继而减少游离氨基酸含量。但CE如何影响微生物的蛋白质水解活性和脱羧酶活性尚不清楚，需要进行体外试验确定。

3.3 CE对仔猪盲肠内容物酚和吲哚类物质含量的影响

吲哚和酚类化合物是芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)细菌发酵的主要代谢产物[26]，是评估肠道蛋白质发酵程度的标志。色氨酸发酵时会产生吲哚和粪臭素，酪氨酸发酵产生苯酚和对甲酚[28]。苯酚会降低结肠上皮细胞的细胞活力和跨上皮电阻，并增加Caco-2细胞对甘露醇的渗透性，破坏肠道屏障功能[28]。在猪的结肠注射苯酚会引起类似于人类克罗恩病的炎症反应[29]。本试验表明，饲粮添加CE能够减少盲肠中的苯酚含量，反映了CE对断奶仔猪的肠道功能的保护作用。对甲酚可通过抑制结肠上皮细胞的增殖和呼吸、增加DNA损伤对结肠上皮细胞产生负面影响[30]。研究认为多酚提取物能够防止对甲酚对Caco-2细胞的和肠黏膜屏障的损害[31]。但是本研究未发现CE减少盲肠中对甲酚的含量，这与柑橘黄酮代谢产物有关。黄酮类化合物通过小肠后作为未吸收和未代谢的黄酮苷或作为胆汁中结合的未代谢的黄酮类化合物到达后肠[32]。不清楚黄酮类化合物或其代谢产物与微生物合成代谢酚类物质的途径。

肠道粪臭素与机体健康状态有关，肠道消化紊乱者的粪便粪臭素水平可高达80～100 μg/g[33]。本试验中CE组盲肠内容物粪臭素含量(10.04 μg/g)远低于80 μg/g，且CE组粪臭素含量显著低于CON组和ANTI组，表明CE缓解了断奶对仔猪肠道消化功能的降低[34]。粪臭素是色氨酸厌氧代谢的终产物，易挥发，是最难闻的气味化合物之一。饲粮添加CE减少了仔猪盲肠内容物中粪臭素的含量，减少了臭味，是动物饲料添加剂的良好指标。粪臭素能抑制嗜酸乳杆菌的生长和发酵[13]，这与本试验CE组盲肠内容物中低粪臭素含量和高乳酸菌数量是一致的。肠道糖含量和脱羧酶是粪臭素生成的重要因素[13]。不清楚CE是否改变了肠道糖含量和脱羧酶活性。CE中的黄酮物质可能通过直接抑制微生物活动或通过减少细菌代谢蛋白质的可用性来减少粪臭素的形成。微生物可以代谢黄酮类化合物，消除糖苷、葡萄糖醛酸苷和硫酸盐，产生黄酮苷元，进一步代谢成各种环裂产物，继而影响微生物的代谢[32]。

3.4 CE对仔猪盲肠内容物生物胺含量的影响

生物胺是由肠道微生物对氨基酸脱羧产生的低分子质量物质，是细胞生长和增殖所必需的[35]。但是高含量的生物胺会对肠道产生不利影响。腐胺、尸胺、亚精胺和精胺对HT29肠道细胞显示出剂量依赖性的细胞毒作用，会导致细胞坏死[36]。腐胺、亚精胺和精胺与结肠癌相关[37]。因此，CE组盲肠内容物中腐胺和精胺含量的减少可以缓解断奶造成的肠道功能降低，即饲粮添加CE可以维持猪的肠道健康[9]。腐胺是由精氨酸或鸟氨酸合成的[38]，腐胺含量的减少可以用血浆氨基酸含量的变化来解释。饲喂CE饲粮的仔猪血浆精氨酸含量较高表明该组中精氨酸发酵减少，腐胺合成减少[9]。与CON组相比，CE组和ANTI组的盲肠内容物中鸟氨酸和脯氨酸含量显著下降，CE组盲肠内容物中由鸟氨酸合成的腐胺含量显著减少，但ANTI组盲肠内容物中腐胺含量未减少。这可能是ANTI组血浆精氨酸含量低于CE组造成的[9]。另外，腐胺是精胺和亚精胺的前体。试验中CE组腐胺含量的减少与精胺含量的减少一致。精胺由亚精胺产生[38]，但是本研究中，CE组亚精胺含量与CON组和ANTI组无显著差异，而精胺含量有减少趋势。这可能与肠道优势微生物的生物合成途径有关，即与精胺和亚精胺产生细菌以及精胺和亚精胺吸收细菌数量的高或低有关。

酪胺和组胺是毒性最强的生物胺，酪胺会引起细胞坏死，组胺会诱导细胞凋亡[39]。CE组和ANTI组盲肠内容物中酪胺和组胺含量较低，提示CE和ANTI一定程度上能保护断奶仔猪盲肠屏障功能。微生物和宿主的酶活性相互作用将胆碱转化为有毒的甲胺，会降低胆碱的可利用水平[11]。因此，CE组和ANTI组盲肠内容物甲胺含量的减少表明盲肠微生物改变了胆碱代谢，也可能是ANTI和CE减少了能够产生甲胺的微生物数量。

尸胺、色胺、组胺可以分别由赖氨酸、色氨酸、组氨酸产生[26]。CE组盲肠中合成尸胺的赖氨酸含量显著低于CON组和ANTI组，但是3组间盲肠内容物的尸胺含量无显著差异。尚不清楚CE中黄酮是否影响赖氨酸发酵，是否改变肠道细胞对尸胺的吸收。盲肠内容物中色胺和组胺含量与盲肠内容物以及血浆中的色氨酸和组氨酸含量一致，均不受饲粮处理的影响。这与微生物氨基酸发酵的能力和肠道吸收生物胺的能力有关。

3.5 CE与仔猪肠道蛋白质代谢

肠道微生物的主要氮源是膳食蛋白质、氨基酸、肽、内源性蛋白质和循环尿素。常规猪饲粮中15%～25%的蛋白质到达大肠，但这在很大程度上受到饲粮蛋白质水平和蛋白质消化率的影响[26]。这些微生物同时合成氨基酸和微生物蛋白质，产生各种氨基酸代谢产物[40]。CE提高蛋白质的吸收利用[9]，使得到达大肠的蛋白质减少，蛋白质发酵减少，游离氨基酸含量减少，导致氨基酸代谢产物减少。本试验中CE组盲肠内容物中蛋白质(氨基酸)发酵代谢产物含量的减少，可间接表明蛋白质消化利用率的提高。这与前期研究结果相符，与CON组相比，CE组仔猪日增重提高了9.86%，料重比降低了9.52%[9]。断奶仔猪消化系统发育不完善，不能充分消化吸收营养物质，饲粮中补充CE能提高机体对蛋白质的吸收利用，继而促进动物生长发育。另外，氨基酸发酵分解的代谢产物被认为是粪便气味的主要成分。CE减少了腐败化合物的含量(苯酚、粪臭素、腐胺、精胺、酪胺、甲胺)，这可能减少粪便的臭味，减少臭气排放，有利于改善猪舍环境，提高动物福利。

CE的部分黄酮类化合物(如橙皮苷和柚皮苷)在很大程度上能抵抗胃和小肠的酶促分解，能较完整地到达大肠，在微生物的作用下代谢为酚酸和简单酚类。CE组盲肠中起作用的可能是橙皮素、柚皮素和酚类代谢产物的混合物[41]。不易被小肠吸收的柑橘黄酮及其代谢产物可作为肠道微生物生长的底物，改变这些化合物的生物利用度和营养特性[42]，也会影响肠道微生物的组成和活性。CE组盲肠内容物中蛋白质(氨基酸)代谢产物的改变是由柑橘黄酮化合物及其代谢产物以及与肠道微生物相互作用的综合结果。CE或其代谢产物如何刺激肠道微生物的代谢，改变微生物组成，继而改变蛋白质代谢产物的合成，这需要进行微生物组学以及代谢组学分析确定。

4 结 论

饲粮中添加CE增加了仔猪盲肠内容物中乳酸菌数量，减少了游离氨基酸、苯酚、粪臭素、腐胺、精胺、甲胺的含量以及大肠杆菌数量。