枣和酸枣果实有机酸代谢差异研究

邓 倩，王 羊，邓群仙*，张慧芬，夏 惠，梁 东，王 全

（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；2.四川省广安市邻水县经果技术推广所，四川 邻水 638500；3.四川农业大学果蔬研究所，成都 611130）

枣起源于中国，不仅是中国最古老的果树之一[1]，也是我国特有的果树资源和独具特色的优势果树树种[2]。

有机酸，产生水果重要的口味感觉“酸”，是果实品质及风味物质的主要成分之一[3]。果实的酸味是由有机酸的种类、含量和比例共同决定的。同一种但不同品种的水果，其有机酸组成都可能存在差异，苹果酸或柠檬酸为多数水果的主要有机酸[4]。黄果柑中总酸含量的90%以上为柠檬酸[5]。Y.Soyer等[6]研究结果显示葡萄中的酒石酸含量最高，约为4.98～7.48 g/L。赵爱玲等[7]研究发现酸枣的总酸含量是枣种质的3～5倍，且酸枣以柠檬酸和苹果酸为主，枣果实以苹果酸和奎宁酸为主。

目前果实中有机酸代谢的研究多集中在苹果、柑橘、葡萄及梨等树种上，‘冬枣’和‘骏枣’为北方栽培枣品种，其有机酸代谢研究和全基因组测序已见报道[8-11]。但南方栽培枣品种的有机酸积累规律、相关基因表达等研究较少，而且由于南方阴雨天多、光照弱以及积温不足，导致南方栽培枣果实中有机酸的积累量高于北方栽培枣[12]，对南方栽培枣的鲜食风味影响较大。因此，本试验以原产四川德阳市罗江区，果实长圆柱形，低含酸量的‘罗江调元枣’为材料，以高含酸量的‘圆形小酸枣’为对照[13]，通过测定各发育时期有机酸含量、组分以及相关代谢基因的表达量，进而分析‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’的有机酸代谢差异，为进一步调控南方栽培枣品种中有机酸代谢及枣果实品质与风味的提高提供理论参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于四川省德阳市罗江区白马关镇万佛村五组（N 31°26'34''，E 104°46'18''，海拔约660 m），属于亚热带湿润地区，四季分明，气候温和，年平均气温16.5℃，最高气温为36.6℃，最低气温为-6.7℃；平均年降水量910 mm，无霜期278 d，年平均日照时数1 260 h。

1.2 试验材料

以‘罗江调元枣’（用TYZ表示）和‘圆形小酸枣’（用SZ表示）作为试验材料，皆为露地栽培的根蘖苗，株行距为2 m×3 m。其中‘罗江调元枣’是低酸鲜食枣品种，‘圆形小酸枣’是高酸砧木酸枣品种。枣树树势健壮，生长及结果正常，栽培管理基本一致。

挂牌、采样等采用邓倩等[14]的方法，共采样9次。

1.3 有机酸的测定

有机酸提取以及测定参照孙延芳的方法[15]，并略有改动。取适量样品放入研钵用液氮将其研磨成粉末，准确称取0.5 g充分研磨的样品放入离心管中，再加入3 mL的0.04 mol/L的KH2PO4提取液，摇匀并配平。超声20 min后，常温6 000 r/min离心20 min，取上清液过0.22 μm滤膜过滤待测。色谱柱选用 MZ PerfectSil Target C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为4%甲醇水溶液；流速0.5 mL/min；柱温25℃；检测波长210 nm；进样量10 μL。

1.4 总RNA的提取及cDNA合成

总RNA的提取参照改良CTAB法，并略有改动。cDNA的合成根据TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒说明书进行操作。

1.5 PCR引物设计和反转录产物检测

有机酸代谢相关基因根据NCBI上枣全基因组测序结果，利用Primer Premier 5.0设计定量引物，内参基因引物序列参考张春梅[10]报道的，序列见表1。擎科生物技术（成都）有限公司完成引物的合成。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

以cDNA为模板，经PCR扩增检测反转录产物质量及特异性。PCR体系为2×Taq Mix 10 μL，模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，dd H2O 7.4 μL。反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 1 min，35个循环。所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 荧光定量PCR分析

利用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix without ROX试剂盒（TOYOBO）在CFX Connect型实时定量PCR仪（Bio-Rad，USA）上进行荧光定量PCR。反应总体系10 μL，包含5 μL的THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix without ROX，10 μM 的上下游引物各0.4 μL，1 μL的cDNA模板和3.2 μL的无RNA酶水。反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。采用相对表达量2-ΔΔCT表示基因表达水平。以上每个样品均设3次重复，每次试验设置阴性对照。内参基因为UBQ。以‘圆形小酸枣’花后20 d的表达量为对照，其表达量为1。

1.7 数据处理方法

采用Microsoft Excel及SPSS Statistics 17.0进行数据处理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同发育时期果实中有机酸组分及含量的动态分析

由不同发育时期枣和酸枣果实的有机酸含量动态变化可知（图1），‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’的主要有机酸为柠檬酸和苹果酸。果实发育前期（花后20～55 d），苹果酸为‘圆形小酸枣’的主要有机酸组分，占总酸含量的50%～60%，果实发育后期（花后76～90 d）则苹果酸和柠檬酸各占总酸含量的40%左右。‘罗江调元枣’果实在整个发育时期占主导地位的都是苹果酸，苹果酸含量占总酸含量的50%～90%。

图1-A、1-B和1-E中，从酸含量整体变化趋势来看，‘圆形小酸枣’中苹果酸、柠檬酸和总酸含量呈现上升-下降-上升-下降的变化趋势，柠檬酸和总酸含量在花后62 d达到最大值，而苹果酸含量在花后76 d达到最大值。‘罗江调元枣’中苹果酸、柠檬酸和总酸含量呈现上升-下降的变化趋势，苹果酸和总酸含量在花后62 d达到最大值，而柠檬酸含量的最大值在花后55 d出现。‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中酒石酸含量变化无明显规律（图1-C），而两个品种果实中琥珀酸均从花后69 d开始积累（图1-D）。

图1 枣和酸枣果实不同发育时期有机酸含量变化Figure 1 Changes of organic acid during development in jujube fruits

2.2 不同发育时期果实中有机酸代谢相关基因的表达分析

2.2.1 苹果酸代谢途径中相关基因的表达分析

由图2-A可知，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’中MS的表达量随着果实的发育急剧上调。图2-B中‘圆形小酸枣’果实中FUM的表达呈上调趋势，‘罗江调元枣’果实中FUM的表达则随果实的发育逐渐上调但在果实成熟期下调。图2-C～D中，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中PEPC1主要在果实发育前中期表达，后期则表达量较低，PEPC4的表达则随着果实的发育逐渐上调，于成熟期表达量最高。图2-E～H中，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中的MDH1、MDH4和MDH11的表达都随着果实的发育呈上调趋势，且在花后76～90 d表达量迅速上调。而‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中MDH6的表达则随着果实的发育逐渐下调。图2-I～K中，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中NADP-ME1主要在幼果期有高表达，NADP-ME3和NADP-ME4的表达量变化呈“M”型。

图2 枣和酸枣苹果酸代谢途径中相关基因的表达分析Figure 2 The relative expression level of malic acid metabolism genes during developmental stages of jujube fruit

2.2.2 柠檬酸代谢途径中相关基因的表达分析

由图3-A～D可知，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’中CS1、CS3、Aco2-1和Aco4的表达随着果实的发育逐渐上调。图3-E～G中，‘圆形小酸枣’中NAD-IDH1-2的表达呈现先上调后下调的趋势，而NAD-IDH1-1和NAD-IDH5的表达则随着果实的成熟而波动上调。‘罗江调元枣’中NAD-IDH1-1和NAD-IDH1-2的表达都随着果实的成熟先上调后下调，NAD-IDH5的表达则逐渐上调。图3-H～J中，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’中NADP-IDH1主要在果实成熟期表达。图3-I中，‘圆形小酸枣’中NADP-IDH2随着果实的成熟表达逐渐上调，‘罗江调元枣’中NADP-IDH2在花后20～76 d表达逐渐上调，76～90 d表达量下调。图3-J中，‘圆形小酸枣’中NADP-IDH3的表达在花后20～69 d变化不大，花后69 d开始随着果实的成熟逐渐上调；而‘罗江调元枣’中NADP-IDH3的表达量在花后69～83 d开始随着果实的成熟迅速上调，花后90 d下调。

3 讨论

3.1 枣和酸枣果实有机酸组分与含量

有机酸代谢是一个复杂的过程，自然环境[16]、栽培措施[17]和种质[7]均可影响果实有机酸的积累与含量。本试验采用HPLC法检测了枣和酸枣果实中的有机酸组分及含量，发现‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实的主要有机酸为苹果酸和柠檬酸。赵爱玲等[7,18]用HPLC法检测出酸枣果实中柠檬酸和苹果酸含量相当，而枣果实中苹果酸含量最高，与本试验结果相似。随着果实发育，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中苹果酸占总酸的比例逐渐下降，柠檬酸占总酸的比例逐渐增大。花后90 d，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’中柠檬酸含量分别是2.92和0.72 mg/g，苹果酸含量分别是3.26和3.12 mg/g，由此可见‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’之间总酸含量的差异是由柠檬酸含量的差异造成的。

3.2 枣和酸枣果实酸代谢基因与有机酸组分含量之间的关系

果实生长发育过程中有机酸的合成与降解共同决定了果实中有机酸的含量[4,16]。花后20～69 d，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中PEPC4表达量变化与苹果酸含量变化趋势一致。‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中FUM、PEPC4、MDH1、MDH4及MDH11在花后76～90 d皆有高表达，结合‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中苹果酸含量的变化推测，可能是FUM和PEPC4合成苹果酸，MDH1、MDH4及MDH11降解苹果酸达成平衡，从而导致花后76～90 d‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’果实中的苹果酸含量变化不大。

Shi J.等[19]研究‘红富士’苹果果肉中PEPC的相对表达，发现其与果实中苹果酸含量呈正相关；但马倩倩等[11]认为在枣果实发育过程中ZjPEPC对酸枣中苹果酸的代谢调控作用不大。张春梅等[10]推测MDH对于枣和酸枣中苹果酸含量的增加起到一定的调节作用。根据NCBI上的Blast序列比对可知，MDH1主要定位在线粒体，MDH6主要定位在细胞质中，而MDH4和MDH11主要定位在乙醛酸体中。而有机酸主要在线粒体中产生[20]，由此可推测，FUM和PEPC4在‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’合成苹果酸中起关键作用，MDH1在‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’降解苹果酸中起关键作用。

本研究中，‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’柠檬酸含量的差异是导致总酸含量存在差异的主要因素。花后20～69 d，‘圆形小酸枣’果实中CS1表达量变化与柠檬酸含量变化相似，而Aco2-1、NADIDH1-1及NAD-IDH1-2表达量变化与柠檬酸含量变化相反。而在花后76～90 d，‘圆形小酸枣’果实中柠檬酸含量的变化不大，这可能是由于在此期间CS1合 成柠 檬 酸 ，Aco2-1、NAD-IDH1-1、NADIDH1-2及NAD-IDH5降解柠檬酸达到了一个较为平衡的状态。Zhang G.等[21]研究发现椪柑中CitAco1的下调表达和CitCS1、CitCS2的上调表达可能与柠檬酸积累有关，这与本文研究结果相似。‘罗江调元枣’果实中柠檬酸含量在花后20～55 d的上升可能是由于CS1在此期间表达逐渐上调；花后62～90 d‘罗江调元枣’果实中柠檬酸含量逐渐下降可能是由于NAD-IDH1-2在花后55～90 d表达迅速上调，且Aco2-1、NAD-IDH1-1及NAD-IDH5在花后76～90 d表达迅速上调所致。

G.A.M.Mauricio等[22]在番荔枝中的研究结果和Gao L.等[23]在西瓜中的研究结果都显示CS的表达量可能决定了果实中柠檬酸的积累。张春梅[10]认为CS3促进了枣和酸枣果实中柠檬酸的积累。M.J.Morgan等[24]发现转基因番茄中Aco的表达量显著低于野生型，且转基因植株成熟后果实中柠檬酸和苹果酸含量均增加了50%。杨滢滢等[25]认为脐橙果实中柠檬酸含量下降可能是由CitAco、CitIDH1和CitIDH3上调表达引起的。由此可以推测，CS1在‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’中合成柠檬酸起关键作用，而Aco2-1、NAD-IDH在‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’降解柠檬酸中起关键作用。结合柠檬酸含量与柠檬酸代谢相关基因表达量的变化可以得知栽培枣品种‘罗江调元枣’降解柠檬酸的能力高于‘圆形小酸枣’。

4 结论

本研究通过对枣和酸枣果实中的有机酸组分与含量进行HPLC法测定，发现‘圆形小酸枣’以积累柠檬酸和苹果酸为主，‘罗江调元枣’以积累苹果酸为主。FUM和PEPC4是‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’合成苹果酸的关键基因，MDH1是‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’降解苹果酸的关键基因。CS1是‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’柠檬酸合成的关键基因；Aco2-1、NAD-IDH1-1、NAD-IDH1-2及NAD-IDH5是‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’柠檬酸降解的关键基因。柠檬酸降解基因的差异表达是导致‘圆形小酸枣’和‘罗江调元枣’有机酸含量出现较大差异的原因。