弥漫性大 B 细胞淋巴瘤组织中IP-10及受体CXCR3表达与细胞增殖、侵袭、耐药蛋白表达的相关性

苏智祥，于 滨，魏晓辉，张燕军

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是在我国最常见的一种侵袭性非霍奇金淋巴瘤(NHL)，通过免疫治疗联合化疗后有近半数以上的病人可长期存活，但仍有相当一部分病人因淋巴瘤进展而死亡。如何进一步评估 DLBCL病人的预后，以及采用生物学分型和制定个体化治疗方案是当前研究的热点之一。重组人干扰素诱导蛋白-10(IP-10)作为一种趋化因子，在实体上皮恶性肿瘤中研究较多，在淋巴瘤的研究报道很少。有报道称初诊的DLBCL病人，外周血IP-10水平越高，提示疾病复发可能性越大并且有着更短的生存时间[1-2]。对于淋巴瘤，目前认为细胞增殖指数、侵袭性蛋白表达增高及化疗耐药蛋白高表达与恶性度增高密切相关。为此，我们主要通过免疫组织化学方法检测淋巴瘤组织中IP-10、CXC亚族趋化因子受体3(CXCR3)、细胞增殖指标Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、白细胞分化抗原44变异体6(CD44V6)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达，探讨IP-10及其受体CXCR3与Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9、P-gp、MRP1表达的关系。现作报道。

1 资料与方法

1.1 标本选择 60例DLBCL标本均来自我院病理科2008-2019年病理存档石蜡包埋标本，所有病人均经活组织检查病理及免疫组织化学证实，按照2016版WHO造血与淋巴组织肿瘤分类标准诊断为DLBCL，纳入观察组。纳入标准:(1)人类免疫缺陷病毒(HIV)检测阴性、EB 病毒阴性、肝脏、肾脏、心脏检查结果为大致正常；(2)年龄18～70 岁；(3)知情同意，并签署知情同意书。选取30例本院外科手术切取的病理为反应性淋巴结增生病人为对照组。

1.2 方法 采用免疫组织化学 S-P 法对病人IP-10、CXCR3、Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9、P-gp、MRP1表达进行检测。取存档蜡块制 4 μm 厚连续切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度脱水，于体积分数0.03的H2O2中室温下孵育15 min ；浸入0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液(pH 6.1)中，微波抗原修复；以体积分数0.10的非免疫性牛血清蛋白封闭，分别加入一抗(1∶200兔抗人多克隆抗体，均购自北京博奥森生物技术有限公司)，于37 ℃温箱中孵育1 h；加入通用型免疫组织化学羊抗兔二抗(购自北京博奥森生物技术有限公司)，37 ℃温箱孵育10 min；DAB显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片。严格按说明书进行操作。以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定标准 IP10及CXCR3阳性常规染色均应定位于肿瘤细胞的细胞质及细胞膜，MMP-9阳性常规染色均应定位于在肿瘤间质及细胞质中，Ki67、PCNA阳性常规染色均应定位于在肿瘤细胞核中。P-gp、CD44V6、MRP1阳性常规染色均应定位于肿瘤细胞膜。所有病人均常规行病理及免疫组织化学检查。所有切片均采用双盲法由2位高级职称病理学专家阅片。结果采用计分方法对染色程度及阳性细胞百分数进行计分。首先将染色强度打分：0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。再将阳性细胞所占的百分比打分，0分为阴性,l分为阳性细胞数≤10%,2分为>10%～50%,3分为>50%～75%，4分为>75%,染色强度与阳性细胞百分比分值的乘积>3分为免疫反应(+)。

1.4 统计学方法 采用χ2检验。

2 结果

2.1 DLBCL病人与对照组相关检测结果比较 DLBCL组病人IP-10、CXCR3、Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9、P-gp、MRP1表达阳性率均较对照组高(P<0.01)(见表1)。在对照组中，Ki-67和PCNA阳性细胞主要集中于滤泡生发中心内，生发中心以外的区域只有极少数散在分布的大细胞呈现阳性反应，分别有2例及1例高表达(不包括生发中心)。

表1 DLBCL 病人与对照组IP-10、CXCR3、Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9、P-gp、MRP1检测表达比较

2.2 DLBCL组织IP-10与Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9、P-gp、MRP1的表达相关性分析 DLBCL组织中IP-10表达与Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9表达之间存在着相关性(P<0.05～P<0.01)，与P-gp和MRP表达之间无相关性(P>0.05)(见表2)。

表2 IP-10与 Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9、P-gp、MRP1的表达相关性分析

2.3 DLBCL组织CXCR3与Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9、P-gp、MRP1的表达相关性分析 DLBCL组织中CXCR3表达与Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9表达之间存在着相关性(P<0.05～P<0.01)，与P-gp和MRP1表达之间无相关性(P>0.05)(见表3)。

表3 CXCR3与 Ki67、PCNA、CD44V6、MMP-9、P-gp、MRP1的相关性分析

3 讨论

IP-10是在研究IFN-γ诱发的免疫应答时，用分子生物学技术从活化 U937细胞株的基因表达产物中筛选出来的，称干扰素诱导蛋白10，IP-10也被命名为CXCL10(C-X-C motif chemokine 10)。后来发现在IFN-γ刺激下，活化的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞、角质细胞等多种细胞也可以分泌、表达的IP-10。IP-10通过与唯一的A亚族趋化因子受体3(CXCR3)结合发挥作用。

IP-10作为一种趋化因子，在实体上皮恶性肿瘤中已经有较多的研究，国内外已有大量文献报道IP-10/CXCR3 的高表达与上皮来源恶性肿瘤的侵袭和转移有关[3-5],并且因此可作为多种上皮恶性肿瘤的一种不良预后的判断指标[6-8]。并有研究[9]报道通过抑制IP-10的TLR通路，可以抑制乳腺癌细胞株的侵袭性转移。

但是IP-10在血液系统肿瘤-淋巴瘤中的研究报道较少。STEPHEN等[1]收集254例新诊断的DLBCL病人血清，检测了30种血清因子，给予标准RCHOP方案联合依帕珠单抗及RCHOP两种方案治疗后发现在这30种血清细胞因子中只有IP-10增高可以作为2种标准化疗方案的疗效及预后指标，治疗前IP-10 水平越高提示疾病复发可能性越大并且有着更短的生存时间。WITZIG等[2]对295例初治的DLBCL给予RCHOP方案化疗，也发现IP-10增高的病人有着更短的无进展生存时间。RCHOP方案是目前仍是众多指南推荐的DLBCL治疗标准一线化疗方案，并被全世界众多国家作为金标准方案使用，然而上述两项研究结果提示在DLBCL病人中，血清IP-10可以作为标准方案治疗效果不佳的预测指标。但对于具体的作用机制未见后续报道。

对于淋巴瘤，目前仍认为细胞增殖指数(如Ki67、PCNA等)、侵袭性蛋白表达增高(如CD44、MMP-9等)及化疗耐药蛋白(P-gp、MRP1等)等高表达与恶性度增高密切相关[10-12]。IP-10的表达与DLBCL的恶性度相关研究国内外都鲜见研究报道。本研究发现，在DLBCL组织中，IP-10及CXCXR3的表达与淋巴瘤细胞的增殖及侵袭指标密切相关，而与淋巴瘤细胞的耐药指标无相关性，因此笔者认为，对于DLBCL病人，IP-10通过IP-10/CXCR3轴可能增强DLBCL细胞的增殖性及及侵袭性，这也可能是血清IP-10水平增高作为标准方案治疗效果不佳的一个原因。HONG等[13]研究发现CXCL具有促进DLBCL病人体内肿瘤细胞及DLBCL细胞株的侵袭性作用，我们的研究与之有相似性，对于DLBCL细胞株是否也有IP-10/CXCR3自分泌机制导致侵袭性增加值得进一步研究。且DLBCL是我国恶性淋巴瘤中最多见的一种病理类型，人们已在其他实体恶性肿瘤中对CXCL10/CXCR3反应轴进行了深入研究并且用于指导治疗[14]，因此，随着对IP-10在DLBCL中作用机制研究不断深入研究，IP-10/CXCR3可能成为RCHOP标准治疗效果不佳DLBCL治疗的一个新靶点，并将为淋巴瘤的分子靶向治疗及免疫治疗赋予崭新的内容及广阔的应用前景。